《Frontiers in Plant Science》：Pan-genomic dissection of the CCT gene family in wheat reveals evolutionary dynamics and regulatory divergence
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引言：CCT（CONSTANS, CO-LIKE, and TIMING OF CAB EXPRESSION 1）基因家族调控开花时间、昼夜节律维持及非生物胁迫响应。然而，此前在小麦中的研究依赖于单一参考基因组，限制了对品种间结构变异的理解。方法：本研究对16
引言：CCT（CONSTANS, CO-LIKE, and TIMING OF CAB EXPRESSION 1）基因家族调控开花时间、昼夜节律维持及非生物胁迫响应。然而，此前在小麦中的研究依赖于单一参考基因组，限制了对品种间结构变异的理解。方法：本研究对16份小麦材料中的CCT基因家族进行了泛基因组分析。结果与讨论：拷贝数从二倍体乌拉尔图小麦（Triticum urartu）的27个到现代普通小麦品种的69–103个不等，亚基因组贡献呈现A > D > B梯度。基于12份普通小麦（T. aestivum）品种的直系同源群分类鉴定出22个核心（Core）、9个软核（Softcore）、2个非必需（Dispensable）和2个预测私有（Private）直系同源群，所有类别均处于强纯化选择下；私有直系同源群需组装水平验证，因为多数品种使用了投影基因模型。蛋白质-蛋白质互作网络分析识别出一小组高度连接的节点，富集于昼夜节律和光周期开花通路，尽管这很大程度上由查询序列本身决定；DeepGOPlus注释进一步支持了它们作为转录调控因子的作用。六倍体小麦的mRNA长度长于四倍体和二倍体，但这可能部分反映注释缺口。启动子顺式作用元件在亚基因组间保守，而同源三联体的配对分析揭示了亚基因组拷贝间的显著表达分化。中国春（Chinese Spring）中的组织特异性分析鉴定出富含种子特异性元件的籽粒偏好基因，胁迫处理则揭示了候选顺式元件，其中WUN-motif和CGTCA-motif经FDR校正后仍显著。这些发现提供了CCT基因家族进化与调控多样化的全面视角，为小麦逆境耐受性和产量改良提供了候选基因。
研究背景与科学问题
CCT（CONSTANS, CO-LIKE, and TIMING OF CAB EXPRESSION 1）基因家族编码含约43–45个氨基酸保守CCT结构域的转录调控因子，依据额外保守结构域分为COL（CCT + B-box）、CMF（仅CCT）和PRR（CCT + REC）三个亚家族。该家族在植物光周期调控、开花时间决定、昼夜节律维持及非生物胁迫应答中发挥核心作用。在拟南芥中，CO通过激活FLOWERING LOCUS T（FT）表达促进开花；水稻中至少18个CCT基因控制抽穗期，如Hd1在不同光周期条件下双向调节开花，Ghd7和Ghd7.1（OsPRR37）则通过Ehd1–Hd3a/RFT1通路延迟抽穗。玉米中ZmCCT和ZmCOL3控制光周期敏感性。此外，CCT基因还参与非生物胁迫响应和产量相关性状。
尽管在其他物种中已有广泛研究，普通小麦（Triticum aestivum L.）中CCT家族的研究仍然有限。普通小麦为异源六倍体（AABBDD），基因组庞大复杂。此前Zhang等人（2022）在中国春参考基因组中首次鉴定了127个CCT基因，并分为40个簇，其中VRN2（TaCMF8）抑制春化作用，TaZIM-A1通过结合TaCO1和TaFT-1启动子延迟开花。然而，这些研究依赖单一参考基因组，未能捕获不同品种间的结构变异、拷贝数变异和表达分化。随着高质量小麦基因组组装的涌现和泛基因组学方法的成熟，从群体水平表征CCT家族已成为可能。
研究方法概述
研究人员选取涵盖二倍体、四倍体和六倍体共16份代表性小麦材料及其祖先种，利用HMMER基于Pfam CCT结构域（PF06203）进行全基因组蛋白序列搜索，并通过NCBI Batch CD-Search和SMART数据库验证结构域完整性，最终鉴定CCT家族成员。采用OrthoFinder v2.5对12份普通小麦品种进行直系同源群（orthogroup）分类，分为核心（Core，100%品种存在）、软核（Softcore，≥90%）、非必需（Dispensable，<90%但≥2品种）和私有（Private，仅1品种）。使用KaKs_Calculator计算旁系同源基因对的Ka/Ks比值评估选择压力。利用PlantCARE数据库预测启动子顺式作用元件。运用MCScanX进行共线性和片段重复分析。整合公共RNA-seq数据分析组织特异性和胁迫响应表达模式，采用DESeq2鉴定差异表达基因，并使用Friedman检验评估同源三联体亚基因组表达差异。通过STRING数据库构建蛋白质-蛋白质互作网络，利用AlphaFold2预测TaHd1、OsHd1和AtCO的三维结构并进行叠合比较。qRT-PCR验证六个代表性基因的组织表达模式。
研究结果
3.1 小麦泛基因组中CCT基因家族的全基因组鉴定与基本特征
研究人员在16份小麦材料中系统调查了CCT家族拷贝数分布。现代普通小麦品种含69–103个成员，远多于二倍体乌拉尔图小麦（27个）和四倍体材料（53–55个），表明该家族在面包小麦进化中经历了显著扩张。亚基因组贡献呈现A > D > B梯度（A基因组380个，35.4%；D基因组350个，32.6%；B基因组343个，32.0%），B亚基因组为最小贡献者。与Zhang等人（2022）报告的127个和Tian等人报告的80个基因的比较显示，差异主要源于CCT家族边界定义和结构域完整性阈值不同。
3.2 CCT蛋白理化性质在不同倍性水平和亚基因组间的分化
蛋白质水平分析显示，A基因组含515个CCT蛋白（38.1%），B基因组439个（32.5%），D基因组396个（29.3%）。平均蛋白长度从A（386.9 aa）到B（392.4 aa）到D（397.8 aa）递增，分子量呈相同趋势，而等电点递减。D基因组倾向于编码更长、略偏酸性的蛋白，A基因组蛋白不稳定性更高。六倍体品种理化参数离散度最大，四倍体和二倍体范围较窄。DeepGOPlus功能注释确认所有蛋白均被分配至少一个GO术语，最常分配的生物学过程类别为“生物调控”（GO:0050789）和“细胞过程”（GO:0009987），分子功能类别为“结合”（GO:0005488），与该家族作为转录调控因子的已知功能一致。
3.3 小麦泛基因组中CCT基因家族的基因结构与保守基序架构
六倍体小麦品种的平均mRNA长度（2,363–3,425 bp）和CDS长度（1,151–1,324 bp）通常长于四倍体和二倍体，但mRNA长度与CCT基因数量间无明确线性关系。以中国春和斯卑尔脱小麦为代表进行的整合分析显示，两个物种的CCT基因形成不同的单系分支，并依据染色体组进一步亚聚类。中国春的平均mRNA长度持续长于斯卑尔脱小麦，主要归因于其更长的5'UTR和3'UTR。保守基序分析鉴定出Motif 1（~65 aa）为几乎所有基因共享的核心功能结构域，同时存在谱系特异性基序分布模式。
3.4 小麦泛基因组中CCT基因家族的直系同源群分类与进化约束
在12份普通小麦品种中鉴定出35个直系同源群，包括22个Core（62.9%，791个基因拷贝）、9个Softcore（25.7%，314个拷贝）、2个Dispensable（5.7%，30个拷贝）和2个预测Private（5.7%，15个拷贝）。稀度分析显示泛基因组曲线接近饱和，而核心基因组曲线仍略有下降，表明泛基因组大致封闭但核心集可能未完全饱和。选择压力分析显示，几乎所有类别的旁系同源基因对Ka/Ks值远低于1（Core中位数0.212，Softcore 0.314，Dispensable 0.268，Private 0.214），表明这些重复基因主要受强纯化选择作用。
3.5 启动子顺式调控元件组成与亚基因组特异性调控分化
对中国春98个CCT基因启动子区域的分析将顺式作用元件分为六大类。基础启动子元件（TATA-box和CAAT-box）占主导地位，平均每基因分别含24.1个CAAT-box和20.9个TATA-box。胁迫相关元件为第二丰富类别，平均每基因29.8个，A基因组基因略高于B和D基因组。光响应元件平均每基因8.6个，激素和发育相关元件丰度较低。整体上，顺式元件在A、B、D亚基因组间未呈现显著的亚基因组偏向分布。
3.6 CCT基因家族在亚基因组和倍性水平的共线性与片段重复分析
在中国春六倍体基因组中，30个CCT基因（30.6%）位于片段重复区块内，未检测到串联重复事件。这些片段重复主要发生在不同染色体之间。跨倍性共线性分析显示，大多数中国春CCT基因在四倍体野生二粒小麦和二倍体乌拉尔图小麦中存在直系同源基因，表明包含CCT基因的基因组区块已在二倍体和四倍体祖先中建立，并在多倍化过程中得以保留。
3.7 TaCSCCT基因家族的组织特异性表达模式与亚基因组表达分化
组织表达谱显示CCT家族成员间高度分化的表达谱，层次聚类将其分为四个共表达模块。籽粒高表达基因的启动子显著富集种子特异性元件如RY-element和GCN4_motif。对四个同源三联体的配对Friedman检验显示，所有三联体在15个条件间均表现出显著的A、B、D拷贝表达差异，表明同源拷贝已发生显著表达分化。
3.8 植物激素与非生物胁迫下的表达动态
整合植物激素处理和干旱、热、冷胁迫转录组数据发现，ABA和JA对基因表达调控效应最显著，多数基因在ABA处理下大幅下调。干旱和热胁迫下，部分基因表现出早期响应或持续诱导模式，联合胁迫下某些基因呈现叠加效应。冷胁迫下，家族成员既有显著上调也有显著下调，表明该家族包含冷胁迫应答的正向和负向调控因子。Spearman相关性分析经FDR校正后，仅SA处理下WUN-motif和CGTCA-motif/TGACG-motif/as-1与上调显著正相关，干旱加热联合胁迫下CCAAT-box和MYB识别位点显著正相关。
3.9 小麦CCT基因家族的蛋白质-蛋白质互作网络与结构保守性
基于STRING数据库的高置信度PPI网络包含97个CCT蛋白中的23个，鉴定出少数高度连接节点，如TraesCS6B02G253900.1（TOC-B1，degree=16）和TraesCS2A02G081900.1（degree=16）。富集分析最显著条目为“植物昼夜节律”和“光周期开花调控”，但这一富集很大程度上具有循环性。AlphaFold2预测的TaHd1、OsHd1和AtCO单体结构三维叠合显示，三者核心骨架高度保守，核心区域Cα原子RMSD为0.32–0.42 ?，特别是N端B-box结构域和C端CCT结构域的关键功能残基空间排列一致。
3.10 代表性CCT基因组织特异性表达的qRT-PCR验证
qRT-PCR验证了六个代表性基因在根、茎、叶、穗和籽粒五个组织中的表达模式，大体确认了转录组数据的表达谱。TraesCS1B02G478700呈现强籽粒偏好表达，TraesCS2A02G081900在叶片和茎中最高，TraesCS4B02G115100呈相对组成型表达，同一同源三联体的三个基因均呈现穗偏好表达。
讨论与结论
研究人员指出，基因复制和多倍化是植物基因家族扩张和功能多样化的根本驱动力。现代普通小麦CCT基因拷贝数（69–103）远超二倍体和四倍体近缘种（27–55），与在其他多倍体作物中的观察一致。然而，亚基因组贡献呈现A > D > B梯度，与此前基于单一参考基因组在中国春中报道的B > A > D梯度形成对比，凸显了泛基因组方法在捕获品种间结构变异方面的重要性。六倍体斯卑尔脱小麦（73个成员）基因数明显少于现代品种，支持CCT家族在驯化和育种选择后进一步扩张的假说。
在12份普通小麦品种中，CCT泛基因组包含35个直系同源群，其中Core占62.9%，Softcore占25.7%。稀度分析表明泛基因组曲线接近饱和，核心基因组曲线仅略有下降，提示相对封闭的架构。两个预测Private直系同源群仅存在于TaLDM中，但因多数品种使用投影基因模型，此结果应视为初步结论，需组装水平验证。选择压力分析显示所有类别均主要受纯化选择。
共线性分析表明，CCT基因扩张主要由全基因组复制及随后的区块保留驱动，而非局部串联或转座子介导的扩增。跨倍性保守的共线区块暗示这些基因组区域可能受到剂量平衡或功能保守的选择。
表达分析揭示同源拷贝间已发生显著表达分化，D基因组拷贝在某些三联体中获得了胁迫响应顺式元件并保留了种子特异性RY元件，推动了同源基因的新功能化和亚功能化。AlphaFold2结构比较提示TaHd1与OsHd1和AtCO的核心结构高度保守，但这些仅为计算预测，需实验验证。
总之，本研究提供了CCT基因家族在小麦中进化动态和调控多样化的全面视图，为小麦逆境耐受性和产量改良提供了候选基因资源，同时也为利用泛基因组方法挖掘重要农艺性状基因提供了参考范式。
