科威特市售食品与饲料中授权转基因玉米MON810事件的微滴数字PCR（ddPCR）绝对定量及加快食品安全立法的必要性

《Kuwait Journal of Science》：Absolute quantification of the authorized GM maize event MON810 in food and feed commodities sold in Kuwait’s market by ddPCR: The need to expedite the enactment of food safety legislation

采用微滴数字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）对玉米源性产品中的MON810事件进行了定量。食品中的MON810玉米事件符合转基因生物（genetically modified organism, GMO）标签制度。饲料中的MON810玉米事件超过了0.9%的允许阈值水平。有必要加快科威特食品安全立法的颁布。

Suad S. Al Mazrooei与Dalal R. Alreshidi针对科威特市售玉米源性食品和饲料中MON810的绝对定量开展研究。全球基因工程（genetically engineered, GE）作物种植面积增长，公众生物安全关注增加，相关监管要求对GMO事件进行标签和溯源；欧盟规定授权GMO含量超过0.9%/成分需标签，待授权事件饲料阈值为0.1%/成分，其他主要贸易国授权GMO阈值多为1%—5%，美国和加拿大为自愿标签。科威特尚无GMO标签国家立法和进口授权GM商品认证监管体系；此前基于调控遗传元件筛查发现当地市场存在未标签进口GMO食品和动物消费商品，但事件来源和含量未知。市场控制需可靠检测和定量GMO，要求分析系统精确、准确、成本有效、可重复和可重现；GMO事件计量溯源需欧盟转基因食品和饲料参考实验室（European Union Reference Laboratory for Genetically Modified Food and Feed, EURL GMFF）验证方法和有证标准物质（certified reference material, CRM）。数字PCR（digital PCR, dPCR）较实时定量PCR（real-time quantitative PCR, qPCR）在检测限和复杂基质中更可靠，耐PCR抑制剂，无需参考校准品或标准曲线即可精确测转基因拷贝数；其中微滴数字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）将DNA反应分割为水油乳液微滴，依泊松分布对PCR阳性微滴绝对计数。GMO定量常以GM转基因与分类群特异性内参基因（taxon-specific endogene）的绝对拷贝数比表示，双链ddPCR同时定量转基因和内参，经CRM的转换因子（conversion factor, CF）转为质量分数。MON810（唯一标识MON-??81?-6）在玉米基因组中为单插入，含来自土壤细菌苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）的3′-截短cry1Ab蛋白编码基因，受增强花椰菜花叶病毒（Cauliflower mosaic virus, CaMV）35S启动子和热激蛋白70（heat shock protein 70, hsp70）前导序列控制，无终止子序列。研究人员使用EURL GMFF预验证事件特异方法，对GMO阳性玉米源性材料进行定性PCR和定量ddPCR绝对定量，目标是在实验室实施并验证ddPCR系统，而非方法验证或法规控制。作者从既往科威特市场经常规PCR证明GMO阳性的产品中选取一种加工食品面粉和一种未加工饲料种子粉；食品为0.58%±0.15%（k=2），符合0.9%阈值；饲料为0.94%±0.12%（k=2），略超阈值。结果尤其饲料结果提示科威特需加快食品安全立法并建立常规GMO定量和市场监管能力。

关键技术方法：测试材料为加工食品面粉和未加工饲料种子粉，均来自此前科威特市场经常规PCR证明GMO阳性的样品；CRM购自JRC-Geel（Belgium），含ERM-BF413gk（约10% MON810）和ERM-BF413ak玉米空白。gDNA经质控后，先以构建特异和事件特异定性PCR确认MON810；再用MON810事件特异引物/探针与hmg（high mobility group I protein，高迁移率族I蛋白）内参双链ddPCR，XhoI消化gDNA，BioRad QX100平台检测，QuantaSoft分析，保留≥10 000个可接受液滴的反应；按GM含量%（m/m）=（cp_MON810/cp_hmg）×（1/CF_CRM）×1000计算，CF_CRM=0.36±0.04；评估动态范围、检测限（limit of detection, LOD）、定量限（limit of quantification, LOQ）、线性、精密度和正确度。

研究结果：
3.1 定性MON810特异性PCR：构建特异PCR跨越hsp70内含子与cry1Ab连接区，阳性对照和两种测试材料均扩增出113 bp条带，玉米空白和NTC无扩增，说明材料源自Bt转基因玉米；事件特异PCR跨越异源插入与玉米基因组连接区，阳性对照和两种材料均获170 bp条带，阴性和NTC无条带，说明食品和饲料均含MON810 DNA。XhoI酶切gDNA经in silico分析无MON810和hmg靶标位点，酶切后仍可成功扩增。
3.2 定量MON810特异性ddPCR
3.2.1 双链ddPCR测定MON810事件拷贝数的性能：采用未优化或修改的预验证双链ddPCR，几乎所有反应>10 000液滴，NTC无阳性液滴；CRM阳性样品在FAM（MON810）和HEX（hmg）通道正负液滴清晰分离，rain少且无额外群；FAM分离因子k=5.04，高于HEX的4.78；二维图四群清晰分离，说明引物和探针可同时高效检测MON810与hmg。XhoI酶切gDNA使分离略改善、rain稍减少，故后续采用。
3.2.2 ddPCR关键性能参数的内部验证：与10% MON810 CRM比较无显著差异，说明正确度；以CRM重量稀释评估动态范围、LOD、LOQ和线性。100 ng DNA输入时MON810和hmg主测值分别为3585和36249 cp/rxn，接近预期3633和36630 cp/rxn；23 cp/rxn时最大相对重复性标准差（relative repeatability standard deviation, RSDr）为17.07%和17.64%，最大偏倚为-14.9%和-19.9%；稀释样品与最高浓度平均绝对cp/rxn差异≤20%，无抑制。MON810在10¹—10⁴ cp/rxn内R²=0.9978，hmg在10¹—10⁵ cp/rxn内R²=0.9980；MON810的LOD/LOQ为19/38拷贝，hmg为18/75拷贝。结果表明双链ddPCR可准确量化且重复性良好。
3.2.3 MON810事件的绝对定量及GM分数转换：QuantaSoft计算5个独立提取重复的MON810/hmg拷贝数比，食品0.21±0.05、饲料0.34±0.02（k=2）；转为GM质量分数后，食品0.58%±0.15%（m/m，k=2），低于0.9%阈值，符合标签制度；饲料0.94%±0.12%（m/m，k=2），略超0.9%允许水平。

讨论部分总结：讨论指出MON810为广泛种植的授权GM玉米之一；既往当地市场无GMO标签的玉米源性食品和饲料产品GMO阳性，本研究从该组选样并先定量PCR确认MON810，再以事件特异双链ddPCR定量。所用方法此前由qPCR完全验证并在dPCR中初步验证；因主要目标是建立ddPCR系统，未额外优化，依据是qPCR转ddPCR不一定需进一步优化且双链与单链性能相当。rain信号可能主要依赖方法，去rain需重设计引物或靶序列，超出研究目标；作者不排除优化可提高分离。限制酶降低模板DNA大小受欧洲GMO实验室网络（European Network of GMO Laboratories, ENGL）推荐；本研究中酶切仅略改善分离，与既往MON810双链ddPCR相似，尚需确认是否必需。方法内部验证评估特异性、正确度和准确度；因关键反应条件尤其引物/探针浓度和退火温度保持不变，未评估稳健性。实验室具备双链ddPCR定量能力；FAM分离因子高于HEX与既往一致；动态范围满足RSDr<25%和相对偏倚<25%的接受标准；重复测量变异性符合ENGL，单实验室不强制估计重现性；无特异性扩增且PCR抑制剂低于关键阈值，假阳性/阴性信号发生率低；LOD和LOQ符合最低性能参数。GM含量的可溯源测量是标签合规关键；ddPCR适合准确精确测定GM事件真实DNA拷贝数；为规避杂交玉米半合子问题，研究用事件特异双链ddPCR并结合CRM的CF将MON810/hmg拷贝数比（k=2）转为质量分数。CRM测量值与认证值无显著差异；若将CRM实测质量分数理论换算拷贝数比约0.37，与既往报告纯半合子种子材料玉米CRM在雄性转基因供体时理论0.33—0.5一致；种子饲料平均拷贝数比在此范围内，加工食品较低。扣除扩展测量不确定度后食品未超过0.9%，饲料0.94%略超允许水平。液滴体积是测量不确定度来源，QX100的QuantaSoft假设液滴体积0.85 nL，相关偏倚可为-3%至-4%，但对相对DNA拷贝数比影响很小，故未计入；阈值自动设置，其不确定度贡献可忽略。

研究结论（译）：总之，研究人员已适当实施一种预验证的事件特异双链ddPCR方法，并在精密度和正确度方面以足够准确性定量了两种食品和饲料材料中的MON810玉米事件含量。所有实验均满足定量dPCR数据发表的最低信息和要求。尽管所测样本数量过少，不足以支持广泛的法规结论，但本研究结果，尤其是饲料材料的结果，突出表明：鉴于GE作物生产持续增长，有必要加快国家食品安全相关立法的颁布。然而，仍需进一步工作，将已建立的ddPCR系统与qPCR系统进行比较，以评估其作为科威特常规GMO定量首选方法的适用性；这需要检测大量且多种植物源性材料，并纳入其他授权GMO事件。此外，建议评估其他非商业液滴平台在常规GMO定量中的可靠性。