新型复合杂合DOCK2突变导致早发性反复感染的病例报道

《Frontiers in Immunology》：Novel compound heterozygous mutations of DOCK2 associated with early-onset recurrent infections

　　

引言： 胞质分裂专司蛋白2（DOCK2）缺乏是一种罕见的联合免疫缺陷病，其特征为细胞免疫和体液免疫均存在缺陷，由DOCK2基因的致病性突变引起。本文报告了一名3岁8个月的中国女童，表现为反复感染、免疫性血小板减少症（ITP）、IgE水平升高以及一次噬血细胞性淋巴组织细胞增多症（HLH）样发作，旨在拓展DOCK2缺陷的临床表型谱。 方法： 所有检测和分子遗传学分析均在获得父母知情同意后进行。人口统计学、临床及实验室数据来源于门诊和住院记录。研究人员对患者外周血细胞进行全外显子组测序（WES）以确定遗传病因，随后进行免疫学评估（包括淋巴细胞亚群分析、T细胞受体Vβ库分析及中性粒细胞氧化功能检测）和计算机模拟预测。采用Sanger测序验证所鉴定的变异。 结果： WES在DOCK2基因中鉴定出两个新的复合杂合变异（c.106 C>T, p.R36X 和 c.2150T>C, p.L717P），分别遗传自父母一方。免疫学评估显示存在涉及T细胞和B细胞的联合免疫缺陷，包括T/B细胞亚群减少、TCR库偏斜以及T细胞增殖受损。计算机模拟分析表明，这些变异影响高度保守的氨基酸残基，并可破坏蛋白质结构。患者接受了支持治疗、定期静脉注射免疫球蛋白替代疗法及磺胺类药物预防，病情得到有效控制。 讨论： 本病例拓展了DOCK2缺陷的基因型和表型谱，并强调了其在人体免疫调节中的关键作用。同时，本研究也凸显了早期遗传诊断对于指导及时临床管理的重要性。然而，本研究未进行功能性验证实验以进一步确认所鉴定变异的致病性，因此有必要开展进一步的蛋白质表达研究。

论文解读

研究背景与目的

胞质分裂专司蛋白2（DOCK2）是DOCK-A亚家族成员，主要在造血和淋巴组织中表达，作为关键的鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）调控小Rho GTP酶特别是Rac的活性。DOCK2通过其DHR-2结构域介导Rac的GDP-GTP交换，激活的Rac参与肌动蛋白细胞骨架重塑，进而影响淋巴细胞迁移、中性粒细胞趋化、活性氧（ROS）产生、I型干扰素和TNF-α生成以及免疫突触形成等一系列免疫相关细胞过程。2015年，Dobbs等人首次描述了五例因DOCK2双等位基因功能缺失（LOF）变异而表现为早发重症病毒和细菌感染的患者。DOCK2缺陷会导致严重的免疫功能障碍，影响多种白细胞群体，临床上通常表现为早发性、复发性侵袭性感染伴T细胞和B细胞淋巴细胞减少，符合联合免疫缺陷病（CID）的特征。此外，还可能出现慢性腹泻、血小板减少、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症（HLH）和癫痫等表现。未经造血干细胞移植（HSCT）的患者常因反复呼吸道和胃肠道感染而在早年死亡。目前，DOCK2缺陷的临床谱系和病理生理机制仍不完全清楚。本研究旨在通过描述一例携带新型DOCK2复合杂合变异的中国女童的临床表现和免疫表型，进一步拓展DOCK2缺陷的表型和遗传谱系。

研究方法

研究人员从深圳市儿童医院招募了研究对象，基于临床特征、全外显子组测序（WES）和免疫细胞功能评估进行诊断。首先，提取患者及其父母外周血细胞基因组DNA，利用Illumina HiSeq 2000测序仪进行WES，并将序列比对至人类参考基因组（hg19）。使用PolyPhen-2、SIFT和VariantTaster三种算法预测变异的功能效应，并进行跨物种氨基酸保守性分析，最终通过Sanger测序验证致病性变异。其次，通过皮下注射肾上腺素后监测外周血白细胞动员情况，评估免疫细胞运输功能。利用二氢罗丹明（DHR）-1,2,3流式细胞术检测中性粒细胞产生活性氧（ROS）的能力。采用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记法结合流式细胞术（FCM）评估经植物血凝素（PHA）或抗人CD3/CD28抗体刺激后的T细胞增殖情况。通过PCR扩增T细胞受体（TCR）Vβ片段并进行CDR3谱型分析，评估TCR Vβ多样性。最后，利用细胞内细胞因子染色和流式细胞术分析Th1/2/17亚群比例，并使用特异性抗体进行详细的淋巴细胞免疫分型。

研究结果

DOCK2缺陷患者的临床表现

患者为一名3岁8个月的中国女童，来自非近亲婚配家庭。其姐姐在2.3岁时因严重感染并发急性肾衰竭去世。患者在7月龄时出现发热咳嗽，胸部CT显示弥漫性间质性肺炎，伴有铁蛋白升高、血细胞减少、噬血现象，病原体检测阴性，表现为一次HLH样发作，经抗感染和静脉注射免疫球蛋白（IVIG）治疗后恢复。1.8岁时，患者发生手足口病并发免疫性血小板减少症（ITP）。此后，实验室检查频繁显示淋巴细胞减少和粒细胞减少。在2.3至3.4岁期间，患者经历五次反复发作的肺炎或支气管炎，检出的病原体包括副流感病毒、甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、流感嗜血杆菌、博卡病毒、肺炎链球菌和人偏肺病毒。此外，她还两次患上腮腺炎，一次鼻窦炎。随后，她因反复发热、咳嗽和流涕持续超过两个月而三次住院。尽管症状暂时改善，但停用抗生素后复发。患者开始接受规律的IVIG替代疗法联合磺胺类药物预防后，末次随访未见进一步感染。

DOCK2基因的复合杂合变异

全外显子组测序（WES）揭示了DOCK2基因的复合杂合变异：c.106 C>T (p.Arg36Ter) 和 c.2150T>C (p.Leu717Pro)，分别遗传自父亲和母亲。p.R36X变异的Variant Taster和GERP++预测评分分别为1和3.98，提示具有致病性和高进化保守性。p.L717P变异的SIFT、PolyPhen_2、Variant Taster和GERP++预测评分分别为0、0.998、1和5.58，提示为可能有害或很可能有害、致病且高度保守。Sanger测序证实了这两个变异。结构建模预测这些变异会改变蛋白质构象。在与反复感染、HLH、骨髓发育不良、粒细胞减少、淋巴细胞减少或血小板减少相关的其他基因中未发现致病性变异。对患者外周血单个核细胞（PBMC）进行的qPCR分析显示，DOCK2 mRNA表达水平与健康对照无显著差异。

T/B细胞亚群破坏和TCR库偏斜

患者的淋巴细胞计数低于正常范围。流式细胞术（FCM）分析显示，患者总淋巴细胞、CD4⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞数量均下降，大多数T细胞亚群也减少。B细胞各亚型的数量也低于年龄匹配的对照组。患者的TCR-Vβ亚家族显示单克隆或寡克隆峰。经佛波酯（PMA）和离子霉素刺激后，患者产生干扰素-γ的Th1细胞百分比低于健康对照。此外，患者的T细胞增殖功能受损。

体液免疫和血清细胞因子紊乱

患者血清总IgG、IgM和IgA水平在正常范围内，但总IgE水平显著升高至8805 IU/ml。此外，患者血清IL-6、IL-10和IFN-γ水平升高。

DOCK2缺陷患者的中性粒细胞

患者的中性粒细胞计数低于正常范围。皮下注射肾上腺素后，中性粒细胞计数增加至基线水平的两倍以上。通过DHR试验评估中性粒细胞氧化功能，结果显示患者中性粒细胞中DHR⁺细胞比例为85.3%，刺激指数（SI）为56.9；而对照组的DHR⁺细胞比例为95.3%，SI为95.3。DOCK2患者的呼吸爆发指数低于健康对照组，但在正常范围内。

讨论与结论

讨论总结： 本研究报道了一名表现为早发性反复感染的女童，虽未出现危及生命的重症感染，但疾病发作时常伴有粒细胞减少和淋巴细胞减少。患者在手足口病感染期间出现ITP，并有一次HLH样发作，这与既往病例报道相符。鉴于HLH本身可抑制NK细胞活性，且缺乏急性期功能数据，难以区分原发DOCK2缺陷与继发性HLH介导的抑制作用。DOCK2缺陷损害T细胞发育和功能，患者CD4⁺和CD8⁺ T细胞及其初始亚群均显著减少，TCR多样性轻度偏斜，提示T细胞成熟缺陷。B细胞异常常伴随T细胞缺陷出现，患者CD19⁺ B细胞及其初始、记忆和过渡亚群均减少，总IgG、IgM和IgA正常，但血清IgE显著升高，Th1细胞功能降低而偏向Th2反应，提示B细胞功能受损，可能影响类别转换和整体体液免疫。患者中性粒细胞在急性感染时减少，恢复后可回升，肾上腺素注射后显著增加，呼吸爆发指数低于健康对照但仍在正常范围内。通过二代测序发现的DOCK2新发复合杂合变异c.106C>T（引入提前终止密码子）和c.2150T>C（导致错义取代），在gnomAD中无人群频率，根据ACMG指南均分类为可能致病。错义变异（c.2150T>C）可能是一个亚等位基因，保留了部分蛋白功能，这与患者反复但非致死性的感染表现一致。尽管未进行功能验证，但患者表现出累及T细胞、B细胞和可能NK细胞的联合免疫缺陷，强烈支持这两个变异的高致病可能性。本研究的主要局限性在于未能进行功能性验证实验来确认变异的致病性和生物学效应，且由于患者年龄小，招募年龄匹配的健康对照困难。

研究结论： 研究人员报告了一例携带新型DOCK2复合杂合变异的患者，表现为反复感染、ITP和HLH样发作，并伴有联合免疫缺陷。这些发现拓展了DOCK2缺陷的基因型和表型谱，强调了DOCK2在人体免疫调节中的关键作用，并凸显了早期遗传诊断对于指导及时临床管理的重要性。本研究的一个主要局限性是，由于从幼儿身上获取的外周血量有限且家长拒绝提供额外研究样本，研究人员无法进行蛋白质水平分析或全面的功能测定来直接验证复合杂合突变的致病性。因此，虽然遗传分析和计算机模拟预测强烈提示这些变异很可能具有致病性，但目前尚不能建立明确的因果关系。现阶段，研究人员认为这些复合杂合突变具有潜在致病性，有必要开展进一步的蛋白质表达研究和功能实验来确认其在疾病中的作用。