《Frontiers in Oncology》：ORC1 expression features and its prognostic significance in HBV-associated hepatocellular carcinoma
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目的： 乙型肝炎病毒（HBV）感染是肝细胞癌（HCC）的主要病因。常规生物标志物甲胎蛋白（AFP）和异常凝血酶原（DCP）在诊断方面存在局限，尤其是在早期阶段。本研究探讨了ORC1在HBV相关肝病中的表达谱及其与HBV感染、疾病进展和预后的关系。
方法： 共纳
目的： 乙型肝炎病毒（HBV）感染是肝细胞癌（HCC）的主要病因。常规生物标志物甲胎蛋白（AFP）和异常凝血酶原（DCP）在诊断方面存在局限，尤其是在早期阶段。本研究探讨了ORC1在HBV相关肝病中的表达谱及其与HBV感染、疾病进展和预后的关系。
方法： 共纳入178例受试者：124例HBV阳性病例（49例HBV-HCC、33例HBV-肝硬化、42例慢性乙型肝炎）和54例HBV阴性对照（35例非HBV-HCC、19例肝血管瘤）。通过免疫组织化学检测组织ORC1，并通过ELISA检测17例有可用血清的HBV-HCC患者的血清ORC1。采用Logistic回归识别与ORC1高表达相关的因素。采用ROC曲线评估组织ORC1、AFP和DCP对HBV-HCC的鉴别能力，并分析ORC1与肿瘤直径的相关性。使用TCGA-LIHC数据进行外部验证。
结果： 组织ORC1在HBV阳性患者中显著上调，HBV感染与ORC1高表达独立相关（P<0.001）。ORC1表达从慢性乙型肝炎到肝硬化再到HCC逐渐升高。在17例有可用血清的HBV-HCC患者中，组织和血清ORC1呈中等程度相关（Spearman rs=0.554，95% CI 0.085–0.822，P = 0.021）。组织ORC1在区分HBV-HCC与HBV-LC（AUC = 0.64）及HBV-HCC与CHB（AUC = 0.66）方面显示出中等鉴别能力。ORC1表达与肿瘤直径无显著相关性（P>0.05）。在TCGA-LIHC中，ORC1高表达与较差的总生存期相关（HR = 1.7，P = 0.0026）。
结论： ORC1上调与HBV感染独立相关，并随HBV相关肝病的疾病进展而增加。尽管组织ORC1对HBV-HCC仅显示出中等的鉴别能力，但ORC1高表达与TCGA-LIHC中较差的总生存期相关。这些发现提示ORC1主要作为HBV相关肝病中一个与增殖和进展相关的标志物。
一、研究背景与目的
原发性肝细胞癌（HCC）具有极强的恶性侵袭性。根据GLOBOCAN 2022年估计，肝癌是全球第三大癌症相关死亡原因，2022年约有86.6万新发病例和75.8万死亡病例。HCC的发病率和死亡率几乎持平，这在很大程度上归因于早期筛查系统不足以及大多数患者在中期或晚期才被确诊。在中国，HCC的负担尤为严重，乙型肝炎病毒（HBV）感染是主要病因，约占HCC病例的80%，驱动着典型的“HBV感染–肝硬化–HCC”疾病进程。常规血清生物标志物甲胎蛋白（AFP）存在显著局限：其对早期HCC（BCLC 0期或A期）的检测灵敏度低于40%。此外，在HBV相关活动性肝炎和肝硬化背景下，病毒复制诱导的肝细胞损伤和再生可导致约20%肝硬化患者AFP水平升高，削弱了AFP区分良恶性病变的能力。因此，中国超过一半的HCC患者在中期至晚期（CNLC IIb–IIIa期）才被确诊，导致5年生存率显著降低。补充标志物异常凝血酶原（DCP）在诊断HBV相关HCC方面也存在明显局限，一项荟萃分析报告DCP诊断HCC的总体灵敏度仅为0.66，且在HBV相关肝硬化患者中，血清DCP水平存在15%–25%的假阳性率，早期灵敏度仅为约35%–45%。其他生物标志物如α-L-岩藻糖苷酶（AFU）的早期检出率低于30%，且与HBV相关HCC的发病机制无直接关联。新兴标志物包括循环肿瘤细胞（CTCs）和循环肿瘤DNA（ctDNA）依赖复杂技术、成本高昂、缺乏特异性，不适合作为独立工具进行早期筛查。影像学手段在肿瘤定位方面具有优势，但常规影像学在准确表征亚厘米结节方面仍面临挑战。总之，目前仍缺乏与HBV相关HCC发病机制密切相关、能够有效识别小型早期病变的特异性诊断生物标志物。
HBV整合诱导的生物学功能失调是HBV相关HCC发生发展的关键机制。研究人员在前期使用临床HBV-HCC样本研究病毒整合位点时，观察到HBV S基因高频插入ORC1基因邻近区域，提示该基因组区域是HBV的优选整合热点。ORC1基因主要参与调控细胞周期和启动DNA复制。尽管TERT和MLL4等基因已被明确确立为HBV的常见整合靶点，但ORC1尚未被明确定义为此类靶点。重要的是，ORC1功能障碍直接干扰正常细胞复制周期，这与既往鉴定的整合靶基因机制不同。因此，研究人员假设HBV整合可能导致ORC1失调，从而可能改变肝细胞增殖，这可能有助于HBV相关HCC的致癌过程。ORC1能否作为该疾病特异性诊断生物标志物需进一步评估。基于上述前期发现和ORC1基因的功能特征，本研究旨在表征ORC1在HBV相关肝病中的表达谱，并评估其与HBV感染、疾病进展和预后的关联。
二、研究设计与关键方法
本研究为单中心回顾性研究，纳入2009年7月至2023年8月期间广西医科大学第一附属医院的178例患者，包括42例慢性乙型肝炎（CHB）、33例HBV相关肝硬化（HBV-LC）、49例HBV相关HCC（HBV-HCC）、19例肝血管瘤和35例非HBV相关HCC。研究采用的主要关键技术方法包括：免疫组织化学（IHC）结合图像分析系统定量检测肝组织ORC1蛋白表达；酶联免疫吸附测定（ELISA）检测17例HBV-HCC患者血清ORC1水平；Logistic回归分析识别与ORC1高表达相关的因素；受试者工作特征（ROC）曲线评估ORC1、AFP、DCP对HBV-HCC的鉴别能力；利用TCGA-LIHC队列和GEO数据库（GSE14520/GPL571）进行外部验证；单细胞RNA测序数据（GSE149614）重分析比较肿瘤与癌旁肝细胞中ORC1表达。
三、研究结果
3.1 HBV感染上调ORC1表达。 通过免疫组织化学检测发现，HBV阳性组（CHB、HBV-LC和HBV-HCC）的ORC1表达水平显著高于HBV阴性组（非HBV-HCC和肝血管瘤）。ORC1表达从CHB到HBV-LC再到HBV-HCC逐渐升高，HBV-HCC组表达水平最高（0.27 ± 0.12）。HBV-HCC组织ORC1表达显著高于非HBV-HCC（0.27 ± 0.12 vs 0.16 ± 0.09，P < 0.001）。TCGA数据验证显示肿瘤组织ORC1表达显著高于正常肝组织，且HBV相关HCC的ORC1表达显著高于非HBV相关HCC。单因素Logistic回归识别出HBV感染、性别和年龄为与ORC1高表达显著相关的因素，多因素回归确认HBV感染是ORC1高表达的独立相关因素（校正后OR = 11.91，95% CI 4.02–35.32，P<0.001），且在额外调整HCC状态后该关联仍然显著。ORC1表达与血清HBV DNA载量无显著相关性，GSE14520中慢性携带者肿瘤与活动性复制肿瘤间ORC1表达无显著差异，支持ORC1上调与HBV感染相关而非活动性病毒复制。
3.2 ORC1在HBV相关肝细胞癌中的组织特异性表达。 HBV-HCC和非HBV-HCC肿瘤组织中的ORC1表达均显著高于匹配的癌旁组织，但HBV-HCC中的上调幅度显著大于非HBV-HCC。ORC1表达与DNA复制（R = 0.82）、G2/M检查点（R = 0.88）和肿瘤增殖特征（R = 0.85）强相关。在17例有可用血清的HBV-HCC患者中，组织和血清ORC1水平呈中等程度相关（Spearman rs=0.554，P = 0.021），但在癌旁组织或非HBV-HCC患者中无显著相关性，提示血清ORC1可能部分来源于肿瘤。
3.3 ORC1、AFP和DCP对HBV-HCC的漏诊率。 以病理确诊为金标准，预设阳性阈值AFP ≥ 400 ng/mL、DCP ≥ 40 mAu/mL、组织ORC1 IOD > 0.22，AFP漏诊率为73.47%，DCP漏诊率为26.53%，ORC1漏诊率为22.45%。使用20 ng/mL常规筛查阈值时AFP漏诊率为51.02%。ORC1漏诊率显著低于AFP在两个阈值下的漏诊率。
3.4 组织ORC1对HBV-HCC的诊断不受血清AFP和DCP影响。 组织ORC1表达在AFP阳性与阴性组之间、DCP阳性与阴性组之间均无显著差异。Venn图显示无论AFP或DCP状态如何，ORC1均保持独立阳性分布模式。组织ORC1区分HBV-HCC与HBV-LC的AUC为0.64，区分HBV-HCC与CHB的AUC为0.66。ORC1+AFP联合模型AUC分别为0.67和0.86，加入年龄后进一步提高至0.77和0.93。
3.5 组织ORC1在不同肿瘤直径亚组中的表达。 按最大肿瘤直径<1 cm（n=5）、1–<2 cm（n=9）和≥2 cm（n=35）分层，组织ORC1表达在三组间无显著差异。相比之下，血清log10(AFP)水平在三组间存在显著差异，血清log10(DCP)在<1 cm和≥2 cm组间存在显著差异。ORC1表达独立于肿瘤大小，可能对检测小肝癌具有潜在价值。
3.6 肝细胞中ORC1表达的单细胞RNA测序分析。 在GSE149614单细胞数据集中，HBV-HCC肿瘤肝细胞中ORC1显著高于匹配的癌旁正常肝细胞（0.034 vs 0.002，P = 9.0e-11），且显著高于非HBV（HCV阳性或无明确病因）肿瘤肝细胞（0.034 vs 0.007，P<2.2e-16）。
四、讨论与结论
研究讨论指出，ORC1是DNA复制、细胞周期进展和基因组稳定性的核心调控因子，介导复制许可以确保生理条件下的有序DNA复制。HBV整合可能促成ORC1过表达，从而可能破坏复制稳态、诱导复制应激并干扰RB-E2F通路，可能导致G1/S检查点控制逃逸，进而导致基因组不稳定、染色体畸变和HBV-HCC中的恶性增殖。ORC1表达随疾病进展呈阶梯式增加，但与血清HBV DNA载量无显著相关性，提示ORC1上调与HBV感染相关而非活动性病毒复制。TCGA-LIHC数据显示ORC1高表达与较差总生存期显著相关（HR = 1.7，P = 0.0026），表明其具有风险分层的潜在价值。组织ORC1对HBV-HCC的漏诊率低于AFP且与DCP相当，且在AFP阴性患者中仍能有效检出HBV-HCC，提示潜在的补充价值。ORC1表达不受AFP或DCP状态影响，联合模型可提高诊断性能。组织ORC1表达不随肿瘤直径显著变化，而AFP和DCP水平在小肝癌中显示显著差异或趋势变化，ORC1对检测小肝癌可能具有潜在价值。
研究局限性包括：血清ORC1亚组（n=17）和肿瘤直径亚组样本量有限；单中心回顾性设计需多中心前瞻性队列验证；亚组分析为探索性，未进行多重比较校正；血清ORC1仅在17例HBV-HCC患者中检测，缺乏非HCC的HBV对照，组织-血清相关性不稳定；肝硬化状态与诊断分组共线性，无法构建整合肝硬化状态的综合列线图；ORC1-HBV整合机制源自前期研究，尚未独立复制或功能验证。
研究结论： ORC1在HBV感染的肝脏中上调，其表达沿CHB–肝硬化–HCC序列升高。组织ORC1对HBV-HCC显示出中等的诊断性能，支持其作为现有标志物辅助手段的作用。其表达独立于肿瘤直径，这一特征可能有助于识别小肝癌。ORC1高表达与TCGA-LIHC中较差的总生存期相关。总体而言，ORC1似乎主要作为HBV相关肝病中一个与增殖和进展相关的标志物，其主要临床价值在于预后判断。
