《Journal of Radiation Research and Applied Sciences》：Acupuncture ameliorates neurodamage in STZ-induced AD rat model, accompanied by BNIP3/NIX-related mitophagy signals
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背景：线粒体功能障碍和线粒体自噬缺陷与阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）的病理过程密切相关。尽管针刺在AD中发挥神经保护作用，但其是否通过BNIP3/NIX介导的线粒体自噬发挥作用仍不清楚。
方法：雄性Sprague-Dawley大
背景：线粒体功能障碍和线粒体自噬缺陷与阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）的病理过程密切相关。尽管针刺在AD中发挥神经保护作用，但其是否通过BNIP3/NIX介导的线粒体自噬发挥作用仍不清楚。
方法：雄性Sprague-Dawley大鼠接受侧脑室注射链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）建模，并在百会（GV20）、囟会（GV22）及双侧风池（GB20）穴接受7、14或21天针刺干预，部分大鼠同时给予Mdivi-1处理。针刺干预后，采用Morris水迷宫（Morris water maze, MWM）获得性任务评估空间学习能力。通过TUNEL染色、透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）、蛋白质印迹法（western blotting）及双重免疫荧光技术研究针刺治疗效应背后的线粒体自噬相关机制。
结果：在Morris水迷宫测试中，针刺干预显著缩短了AD大鼠的逃避潜伏期。TUNEL染色显示针刺治疗后海马区TUNEL阳性细胞减少。TEM结果显示针刺改善了海马区域线粒体超微结构异常。蛋白质印迹法显示针刺增加了HIF-1α、BNIP3和LC3蛋白表达，同时下调caspase-3。双重免疫荧光染色显示针刺组LC3与BNIP3/NIX联合标记的共定位增强。此外，给予Mdivi-1加重了认知功能障碍，部分逆转了神经保护效应，并削弱了BNIP3和LC3的上调。
结论：针刺在该AD大鼠模型中发挥神经保护作用，至少部分通过激活可能涉及BNIP3/NIX的线粒体自噬相关信号通路实现。
论文解读
一、研究背景与研究意义
阿尔茨海默病约占所有痴呆病例的60%至80%，是全球第七大死亡原因，以认知退化、推理能力、记忆和行为功能衰退为特征。随着全球老龄化进程加快，预计到2050年AD病例将增加三倍，构成重大医疗负担。AD的两大标志性病理特征为β-淀粉样蛋白（amyloid-β, Aβ）沉积和tau蛋白过度磷酸化。近年来，线粒体功能障碍作为AD发病的又一驱动因素受到越来越多的关注——线粒体损伤促进Aβ沉积和tau蛋白过度磷酸化，而Aβ和tau蛋白反过来进一步损害线粒体的结构、转运和自噬，形成级联损伤。
线粒体是细胞能量稳态的核心，及时清除衰老和受损线粒体至关重要。线粒体自噬（mitophagy）作为选择性自噬清除线粒体的过程，是线粒体监视与维持的核心机制。通过线粒体自噬，神经元清除细胞质和突触区室中的功能失调线粒体，防止受损蛋白积累并维持神经元稳态。在多种AD模型中，实验性恢复受损的线粒体自噬与减轻神经元损伤和改善认知表现相关。BNIP3和NIX（又称BNIP3L）是线粒体外膜上的旁系同源蛋白，均含BH3结构域。在低氧条件下，两者可被HIF-1α转录诱导并直接结合LC3，从而激活自噬机制。
针刺作为一种新兴的补充疗法，在AD中发挥神经保护作用。临床和实验研究表明，针刺可增强认知表现并控制神经炎症过程，其报道的机制包括降低Aβ沉积、抑制tau过度磷酸化和缓解神经炎症。针刺还可改善AD模型中的线粒体结构并保护线粒体功能。然而，针刺是否通过BNIP3/NIX依赖性线粒体自噬调控来恢复线粒体功能仍属未知。基于上述观察，研究人员提出假设：针刺通过BNIP3/NIX相关线粒体自噬缓解AD神经元损伤，恢复线粒体功能并减轻神经元凋亡。
二、研究设计与主要技术方法
该研究采用雄性Sprague-Dawley大鼠（8周龄，体重250-300g），随机分为五组：对照组、模型组（AD大鼠）、针刺组（AD大鼠接受针刺治疗）、抑制剂组（AD大鼠给予Mdivi-1）以及针刺+抑制剂组（AD大鼠同时接受Mdivi-1和针刺治疗）。每个主组进一步分为7、14、21天三个亚组，共进行三次独立生物学重复，总计225只大鼠。样本量通过G*Power软件估算，每组每时间点至少5只大鼠。实验方案经北京中医药大学深圳医院（龙岗）动物伦理委员会批准（批准号：SZLDH2021LSYA-074）。
AD样病理通过双侧脑室内（intracerebroventricular, ICV）注射链脲佐菌素（STZ，3 mg/kg）建立，这是公认的散发性AD样神经退行性疾病模型。针刺干预选取GV20（百会）、GV22（囟会）及双侧GB20（风池）穴位，每日一次，每次留针20分钟。Mdivi-1作为线粒体动力学药理调节剂，通过每日ICV微量注射给药。研究采用的主要关键技术方法包括：Morris水迷宫（MWM）测试评估空间学习能力；蛋白质印迹法（western blotting）检测HIF-1α、caspase-3、BNIP3和LC3蛋白表达；透射电子显微镜（TEM）观察线粒体超微结构；双重免疫荧光染色评估LC3与BNIP3/NIX的共定位；TUNEL染色检测海马神经元凋亡。统计分析采用双因素方差分析（two-way ANOVA）配合Tukey事后检验。
三、研究结果
3.1 针刺增强STZ诱导AD大鼠的空间学习能力
在MWM测试中，STZ诱导的AD大鼠在7、14和21天均表现出显著延长的逃避潜伏期（均p<0.001），确认模型建立成功。Mdivi-1单独处理进一步加重认知损害，表现为所有时间点逃避潜伏期显著长于模型组。针刺显著缩短逃避潜伏期（p<0.001）。针刺联合抑制剂时，大鼠到达平台的时间快于仅用抑制剂组，但慢于单独针刺组。这些发现表明针刺可改善AD大鼠模型的空间学习表现，其机制可能涉及包括线粒体自噬在内的线粒体质量控制通路。
3.2 针刺减轻AD大鼠海马神经元凋亡
TUNEL染色结果显示，模型组各时间点TUNEL阳性细胞数量远多于对照组。针刺显著减少了TUNEL阳性细胞数量。Mdivi-1则使TUNEL阳性细胞数高于模型组。针刺+抑制剂组部分逆转了抑制剂的促凋亡效应，但凋亡水平仍高于单独针刺组。这些结果表明针刺的抗凋亡功能至少部分与线粒体自噬相关。
3.3 针刺调节AD大鼠caspase-3和HIF-1α蛋白水平
蛋白质印迹法显示，针刺治疗在所有评估时间点均显著降低caspase-3蛋白水平。由于仅检测了总caspase-3而非剪切型caspase-3，该降低间接支持针刺可能抑制凋亡活性。抑制剂组caspase-3表达较模型组有中度但统计学显著的增加。针刺+抑制剂组的caspase-3水平低于抑制剂组但仍高于单独针刺组。HIF-1α表达呈现相反模式：针刺组在7、14、21天均表现出显著高于模型组的HIF-1α水平；Mdivi-1给药则显著抑制HIF-1α表达至低于模型水平；针刺联合抑制剂部分缓解了这种抑制。针刺增强HIF-1α表达同时降低总caspase-3信号，且线粒体自噬抑制后针刺对两种蛋白的效应均减弱，提示针刺至少部分通过线粒体自噬通路调节HIF-1α和caspase-3，从而减少神经元凋亡。
3.4 针刺维持AD大鼠线粒体完整性
TEM评估显示，对照组线粒体形态正常，外膜完整，嵴排列有序。模型组线粒体出现明显损伤，包括肿胀、膜破裂和部分嵴丢失。抑制剂组病理变化进一步加重，出现广泛膜破裂和嵴几乎完全丢失。针刺组各时间点线粒体完整性较模型组保持更好，膜相对完整，嵴排列更清晰。针刺+抑制剂组的线粒体损伤较单独抑制剂组部分减轻，但超微结构恶化仍比相应时间点的针刺组严重。这些结果表明针刺有助于维持线粒体结构完整性，而Drp1 GTPase抑制剂Mdivi-1加重线粒体损伤，针刺+抑制剂组的部分改善提示针刺对线粒体超微结构的有益效应与线粒体质量控制相关。
3.5 针刺通过BNIP3/NIX通路增强线粒体自噬
蛋白质印迹法显示，针刺组各时间点BNIP3表达远高于模型组。Mdivi-1单独处理使BNIP3降至模型水平以下。针刺联合抑制剂时BNIP3表达部分恢复，但仍低于单独针刺水平。LC3表达呈现类似趋势：针刺显著增加LC3表达，Mdivi-1处理导致LC3水平降低，针刺+抑制剂组LC3表达较单独抑制剂组增加但未达到针刺组水平。免疫荧光分析显示，针刺显著增加了LC3与BNIP3/NIX的共定位，合并信号更强，共定位指数更高。抑制剂组在第21天LC3与BNIP3/NIX共定位较模型组显著降低。针刺+抑制剂组部分恢复了共定位，但重叠程度仍明显低于单独针刺组，尤其在损伤后21天。由于BNIP3和NIX/BNIP3L是线粒体外膜蛋白，这种增强的共定位与LC3募集至线粒体或线粒体自噬体形成一致，但免疫荧光组合中未包含明确的线粒体标记物，因此不能作为直接证据。
四、讨论与结论
该研究表明，针刺改善了AD模型大鼠的空间学习表现、改善了线粒体超微结构、减少了凋亡相关指标，并增加了STZ处理大鼠海马中BNIP3/NIX和LC3相关信号。当线粒体自噬被药理抑制时，这些神经保护效应被抵消，提示BNIP3/NIX相关线粒体自噬是针刺诱导神经保护的重要过程。研究提出的机制示意图显示：针刺通过线粒体自噬依赖性过程发挥神经保护作用，BNIP3/NIX与LC3相互作用启动自噬体形成，功能失调的线粒体随后被包裹并通过线粒体自噬降解，从而恢复线粒体稳态、保护神经功能并最终改善认知损害。
当前AD药物治疗包括胆碱酯酶抑制剂（AChEIs）、NMDA受体拮抗剂美金刚以及清除Aβ沉积的疾病修饰性抗Aβ单克隆抗体。新兴的抗Aβ单克隆抗体药物虽能有效减少Aβ斑块负担，但在临床治疗中面临挑战。由于涉及多种病理过程，有效治疗可能需要多靶点策略。针刺作为一种非药物疗法，通过多种生物学通路增强AD患者的认知表现。该研究的创新之处在于发现针刺上调BNIP3/NIX和LC3并增强其共定位，表明针刺激活受体介导的、不依赖泛素的线粒体自噬相关通路，这一非药物机制补充了靶向PINK1/Parkin通路的药物策略。研究还观察到针刺协同上调HIF-1α与BNIP3/NIX等关键自噬介质，与HIF-1α-BNIP3/NIX轴一致，但由于未直接操控HIF-1α，不能排除HIF-1α上调是针刺的平行反应。
研究结论：该研究表明，针刺通过激活STZ注射AD大鼠海马组织中BNIP3/NIX介导的线粒体自噬相关通路改善线粒体质量控制。这一效应有助于维持线粒体稳态、抑制神经元凋亡并缓解认知损害。这些发现为针刺保护神经元的机制提供了新的视角，并确定线粒体自噬相关信号作为进一步研究的候选机制。
