《Frontiers in Plant Science》：Pan-genome analysis of the glutathione S-transferase gene family reveals the core and dispensable components of GST evolution in Arachis
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引言：基因家族鉴定与比较分析在很大程度上依赖单一参考基因组，因而无法捕获基因组间的存在/缺失变异。方法：研究人员以直系同源基因群（OGGs）为分析单元，对20个花生属（Arachis）基因组（16个异源四倍体和4个来自二倍体祖先谱系）中的谷胱甘肽S-转移酶（G
引言：基因家族鉴定与比较分析在很大程度上依赖单一参考基因组，因而无法捕获基因组间的存在/缺失变异。方法：研究人员以直系同源基因群（OGGs）为分析单元，对20个花生属（Arachis）基因组（16个异源四倍体和4个来自二倍体祖先谱系）中的谷胱甘肽S-转移酶（GST）家族进行计算分析，并比较不同OGG类别间的基因结构、系统发育、复制、共线性、Ka/Ks以及组织和胁迫转录组中的表达。结果：携带两个典型结构域的1,436个GST被归入57个OGGs，包括存在于全部20个基因组中的18个核心OGGs和39个可弃OGGs（软核心、壳和品系特异性）。该家族在结构上具有一致性，其一致性从核心OGGs到壳OGGs逐渐下降。这些OGGs属于Tau、Phi、Theta和Lambda亚家族，其中57个中有53个属于Tau。全基因组复制/片段复制（WGD/segmental）重复在核心和软核心OGGs中占主导，占核心基因的65.2%；而串联重复在壳基因中占主导，为42.0%；WGD/segmental重复在四倍体GST中所占比例远高于二倍体。核心和软核心OGGs占据与祖先二倍体共享的共线性位置，约一半的跨基因组共线性连接连接A和B亚基因组。在23,399个OGG内基因对中，46个可估计OGGs中有43个的平均Ka/Ks低于1，符合以纯化选择为主；没有Ka/Ks高于1的基因对显著偏离中性，且核心与可弃OGGs之间Ka、Ks和Ka/Ks均无差异。在品种NDH108的22个组织中，全部35个核心基因均表达，9个沉默基因属于软核心或壳OGGs，花萼是最常见的表达峰值组织。在干旱、低温或盐胁迫下，84个NDH108 GST中有74个响应，核心与可弃OGGs中的响应比例相似。讨论：所有结果均为计算分析，未经实验验证。基于OGG的分析解析了单一参考基因组无法捕获的花生属面板中GST含量和基因组组织的变异，其所突出的基因是后续实验研究的候选基因。
研究背景与问题：谷胱甘肽S-转移酶（GST，催化谷胱甘肽结合多种亲电底物的酶超家族）是植物中参与解毒、氧化胁迫缓解、氧化还原稳态和次生代谢等多类过程的多基因家族。既往GST家族鉴定多基于单一参考基因组，将家族视为固定基因集，难以反映种内或种间基因组间的存在/缺失变异（PAV）和拷贝数变异（CNV）。花生（Arachis hypogaea L.）为异源四倍体（AABB，2n = 4x = 40），基因组大且重复丰富，由A基因组二倍体A. duranensis与B基因组二倍体A. ipaensis杂交后染色体加倍形成；近年染色体尺度基因组、端粒到端粒组装和泛基因组资源积累，使在泛基因组尺度系统分析基因家族成为可能。研究人员因此将泛基因组框架应用于GST家族，以直系同源基因群（OGGs）为单元区分核心与可弃组分，解析GST含量、复制和选择压力，为进化研究和候选基因筛选提供资源。
研究人员开展的研究与结论：研究人员分析了20个Arachis基因组（16个AABB、3个AA、1个BB）中的GST家族，鉴定1,436个携带GST_N和GST_C两个典型结构域的GST，归入57个OGGs，并分为18个核心、20个软核心、10个壳和9个品系特异性OGGs；随后比较结构、系统发育、拷贝数、保守基序、复制模式、共线性、Ka/Ks及组织和胁迫表达。结论是：核心与软核心OGGs构成家族主体并以WGD/segmental重复为主，壳OGGs以串联重复为主；核心和软核心OGGs占据与二倍体祖先共享的共线性位置；Ka/Ks总体显示纯化选择；NDH108中全部核心GST表达，沉默基因属于软核心或壳OGGs；多数GST响应干旱、低温和盐胁迫，核心与可弃OGGs响应比例相似。其意义在于提供跨20个Arachis基因组的GST泛基因组资源，揭示单一参考基因组不能捕获的家族组成和基因组组织变异，并提出需实验验证的候选基因。
主要技术方法：研究人员使用20个Arachis基因组的蛋白、CDS和注释（16个AABB、3个AA、1个BB；数据来自NCBI、PeanutPan、GigaDB和figshare），以HMMER hmmsearch搜索GST_N（PF02798）和GST_C（PF00043），经NCBI Batch CD-Search和150–350 aa长度筛选鉴定GST；用OrthoFinder（DIAMOND、FAMSA、FastTree）构建OGGs；用MAFFT、trimAl和IQ-TREE建系统发育树，MEME鉴定保守基序；用MCScanX分析复制模式和共线性；用KaKs_Calculator按NG模型计算Ka/Ks；用PeanutOmics的NDH108 22组织图谱及公共RNA-seq（PRJNA706902干旱、PRJNA751249低温、PRJNA1092346盐）分析表达，Salmon和DESeq2进行定量与差异分析。
研究结果：
3.1 Identification of GSTs across the Arachis panel（花生属面板中的GST鉴定）：基于20个Arachis基因组的蛋白序列和结构域搜索，研究人员共鉴定1,436个GST；四倍体基因组含53–87个GST，二倍体含36–45个（AA）和38个（BB），每个四倍体的GST数约等于一个A亚基因组与一个B亚基因组二倍体之和，符合异源四倍体起源。
3.2 Gene structure of the peanut GSTs（花生GST的基因结构）：基于GFF3注释提取结构，家族整体结构一致，基因长度中位数1,558 bp，蛋白长度中位数224 aa，内含子总长度中位数642 bp；85.9%的基因含1个内含子，88.0%含2个CDS特征，蛋白长度最受约束。
3.3 Core and dispensable GSTs（核心与可弃GST）：基于OGG在20个基因组中的出现情况，57个OGGs分为18个核心、20个软核心、10个壳和9个品系特异性；核心和软核心基因合计约占87%，核心基因占44.08%，软核心占42.97%，壳占12.12%，品系特异性占0.84%；结构一致性从核心到壳下降。
3.4 Phylogenetic classification and subfamily assignment（系统发育分类与亚家族归属）：基于57个OGG代表序列与53个拟南芥GST构建最大似然树，57个OGGs分布于Tau（53个）、Phi（2个）、Theta（1个）和Lambda（1个）；DHAR、Zeta和TCHQD无花生OGG，作者指出这与鉴定标准有关而非基因组缺失；每个GST的BLASTP最佳拟南芥命中均与其OGG亚家族一致。
3.5 Analysis of copy-number variation and protein motifs（拷贝数变异与蛋白基序分析）：基于57个OGGs在20个基因组中的拷贝数矩阵，拷贝数2、1和0分别占37.3%、34.5%和23.2%，拷贝数3和4分别占3.1%和1.9%；核心OGGs拷贝数最高（存在时均值1.76），软核心1.66、壳1.33、品系特异性1.00；MEME显示多数Tau代表序列基序组成和排列相似，Lambda和Phi与Tau不同。
3.6 Gene duplication and expansion（基因复制与扩张）：基于MCScanX分类，WGD/segmental重复占54.46%，串联重复占19.99%，分散和近端重复分别占13.02%和12.05%，单例占0.49%；核心基因中WGD/segmental占65.2%，壳基因中串联重复占42.0%；四倍体中WGD/segmental比例高于二倍体，串联重复比例在二倍体更高。
3.7 Collinearity of the peanut GSTs（花生GST的共线性）：基于基因组内和基因组间MCScanX共线性分析，20个基因组共得430个基因组内GST共线性对，四倍体每个基因组7–32对，二倍体仅1–3对；跨基因组237个同一OGG的共线性对中，125个连接同一亚基因组染色体，112个连接A和B亚基因组；核心和软核心OGGs占125个同亚基因组对中的119个，显示其共线性位置与二倍体祖先共享。
3.8 Analysis of natural selection on the peanut GSTs（花生GST的自然选择分析）：基于23,399个OGG内基因对计算Ka、Ks和Ka/Ks，46个可估计OGGs中43个平均Ka/Ks低于1；14,626个有限比值基因对中93.6%低于1，显著偏离中性的基因对均低于1；3个OGG均值略高于1但无单个基因对显著偏离中性；核心与可弃OGGs间Ka、Ks和Ka/Ks均无显著差异。
3.9 Tissue expression profiles（组织表达谱）：基于PeanutOmics中NDH108的22组织表达图谱，84个GST中83个有表达记录，74个至少在1个组织中表达；全部35个核心基因均表达，9个沉默基因属于软核心或壳OGGs；花萼是最常见的表达峰值组织；核心基因表达广度更高，同一OGG的不同拷贝峰值组织可不同。
3.10 Responses of the GSTs to drought, cold and salt stress（GST对干旱、低温与盐胁迫的响应）：基于三个公共RNA-seq数据集的17个处理-对照比较，84个NDH108 GST中76个至少在一个数据集中表达，74个至少在一个比较中响应，49个响应干旱、61个响应低温、60个响应盐，37个对三种胁迫均响应；485个显著基因-比较组合中78.6%为上调；核心与可弃OGGs的响应比例在干旱、低温、盐下均无显著差异，同一OGG拷贝主要在是否响应上不同。
讨论总结：讨论部分指出，所有结果均为计算分析，未经实验验证；要求同时具有PF02798和PF00043的鉴定标准限定了结论范围，DHAR、Zeta和TCHQD等类别因PF00043匹配差或CD-Search特异性不足而未纳入，故1,436个基因代表典型两域GST而非完整家族；20个基因组包含二倍体祖先和野生四倍体，分类描述的是属级面板中的保守性而非栽培花生访问间变异，且类别是OGG属性而非每个拷贝属性；软核心边界和部分壳类别对数据质量、注释和鉴定标准敏感；结构一致性从核心到壳下降，壳OGGs同时富集串联重复；WGD/segmental重复与核心/软核心相关，串联重复与壳相关，但分类记录当前位置而非复制时间；共线性结果与四倍体同源亚基因组合并及核心/软核心位置稳定相符；Ka/Ks总体支持纯化选择，但面板中多数基因组属于同一栽培种、34.9%的OGG内基因对编码序列相同，限制核心与可弃选择约束比较的检验效能；NDH108中核心基因全部表达、沉默基因属于软核心或壳，但表达是基因属性且仅来自一个品种；胁迫转录组提示候选基因，其中NDH20G43130.1（OG0021802）与AhGST23蛋白相同且为互惠最佳BLASTP命中，并在17个比较中的12个上调，但数据差异涉及基因型、组织、发育阶段和处理，不能证明胁迫功能。
研究结论（译）：本研究在20个Arachis基因组中，基于OGGs对GST家族进行计算泛基因组分析。共鉴定1,436个两域GST并归入57个OGGs，按保守水平分为核心、软核心、壳和品系特异性类别。家族结构一致，且结构一致性从核心到壳OGGs下降。WGD/segmental重复是最常见模式，在核心和软核心基因中占主导；串联重复在壳基因中占主导；WGD/segmental重复在四倍体中远多于二倍体，反映其同源亚基因组。核心和软核心OGGs占据与二倍体祖先共享的共线性位置，约一半共线性连接连接A和B亚基因组。46个可估计OGGs中43个平均Ka/Ks低于1，符合以纯化选择为主，核心与可弃OGGs间未检出差异。NDH108的22组织图谱中全部核心基因表达，沉默基因属于软核心或壳OGGs。三个公共胁迫转录组中多数NDH108 GST响应干旱、低温或盐，核心与可弃OGGs响应比例相似。20基因组OGG分析描述了单一参考基因组不能捕获的GST含量、复制模式和基因组组织变异，其鉴定候选基因需实验验证。
