贝宁新型克雷伯菌噬菌体的分离与表征及其对多重耐药和高毒力肺炎克雷伯菌的抗生物膜活性

《Frontiers in Microbiology》：Isolation and characterization of novel Klebsiella phages from Benin and their antibiofilm activities on multidrug resistant and hypervirulent Klebsiella pneumoniae strains

　　

高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent Klebsiella pneumoniae）代表了一种日益增长的临床威胁，尤其是在多重耐药（multidrug resistance, MDR）限制了治疗选择的情况下。本研究旨在表征在贝宁分离的克雷伯菌噬菌体（Klebsiella phages），并评估其在减少细菌细胞生长、生物膜抑制和生物膜破坏方面的功效。为实现该目标，研究人员以临床多重耐药和高毒力肺炎克雷伯菌菌株为宿主，通过富集医院污水、猪粪和粪便样本分离克雷伯菌噬菌体。利用透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）、全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）和生物学试验对这些噬菌体进行了表征。随后，研究人员在体外评估了其抗生物膜活性以及在严苛条件（pH和温度）下的稳定性。研究报道了从贝宁分离并表征的三株新型裂解性噬菌体（Kp1Bj_HH11_M23、Kp2Bj_LN294_M23和Kp10Bj_LN54_14）。这些肌病毒（Myoviruses）属于Marfavirus属和Jiaodavirus属，对多种多重耐药和高毒力肺炎克雷伯菌菌株具有广谱宿主裂解活性，涵盖多种荚膜血清型，包括KL114、KL53、KL8、KL62、KL64、KL124、KL102、KL57、KL39、KL48、KL17、KL20、KL2、KL30、KL51、KL105、KL146、KL28、KL122、KL38、KL3和KL163。基因组分析确认不存在毒力基因和抗菌药物耐药基因。这些噬菌体表现出快速吸附、短潜伏期（5–10分钟）和高裂解量（119–2208 PFU/细胞）。三株噬菌体在体外均具有显著的生物膜破坏效果（Kp1Bj_HH11_M23，生物膜破坏率为98.46%，p值=0.0170；Kp2Bj_LN294_M23，生物膜破坏率为65.56%，p值<0.0001；Kp10Bj_LN54_14，生物膜破坏率为99.96%，p值=0.003）。它们在较宽的温度和pH范围内保持稳定，进一步支持了其用于治疗开发的潜力。总之，这些数据强调了本地来源噬菌体作为应对区域特异性抗菌药物耐药挑战候选方案的价值。

论文解读：贝宁新型克雷伯菌噬菌体的生物学、基因组学及抗生物膜特性

1. 研究背景与问题

抗生素曾是抵抗病原体的一线手段，在人类和动物健康领域发挥关键作用。然而，数十年来抗生素在人和兽医领域的不加控制使用，加速了细菌耐药性的进化和传播。革兰氏阴性菌，尤其是肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae），构成了多重耐药（multidrug resistance, MDR）病原体的重要部分。肺炎克雷伯菌感染对婴儿、老年人和免疫功能低下患者尤其致命，部分感染死亡率超过50%。抗菌药物耐药性（antimicrobial resistance, AMR）在肺炎克雷伯菌中的日益严重，尤其是多重耐药与高毒力（hypervirulence）特征共存的菌株出现，带来重大临床挑战。2024年初，世界卫生组织报告了携带碳青霉烯酶基因的肺炎克雷伯菌ST23菌株全球出现，这些菌株对最后防线抗生素产生耐药性。高毒力与多重耐药共存与严重感染、高死亡率和有限治疗选择相关，尤其是在低收入和中等收入国家（LMICs）。近期在贝宁的研究显示产超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum beta-lactamase, ESBL）细菌流行率上升、碳青霉烯耐药菌出现；肺炎克雷伯菌是其中最常见病原体之一，例如某北部医院血流感染分离菌中77.6%为肺炎克雷伯菌且均多重耐药，尿路感染分离株中ESBL阳性率达68.9%，碳青霉烯耐药分离株显著增加。生物膜形成是肺炎克雷伯菌的主要毒力因素之一，增强耐药性和免疫逃逸，使感染更持续难治。因此需要寻找新策略。噬菌体（phage）疗法成为有前景的替代方案。然而贝宁缺乏针对本地临床相关肺炎克雷伯菌株的噬菌体数据。本地噬菌体具有感染在当地流行的多样化菌株的优势，可能为治疗多重耐药和高毒力肺炎克雷伯菌感染提供候选药物。本研究旨在分离、进行生物学和基因组学表征、评估宿主范围及抗生物膜活性，研究对象是贝宁本地分离的克雷伯菌噬菌体。

2. 研究内容与结论

研究人员从贝宁采集的医院污水、农民粪便和猪粪样本中，以临床多重耐药和高毒力肺炎克雷伯菌为宿主，分离获得三株新型裂解性噬菌体：Kp1Bj_HH11_M23、Kp2Bj_LN294_M23和Kp10Bj_LN54_14。通过透射电子显微镜（TEM）、全基因组测序和生物测定对这3株噬菌体进行了表征，并评估了其宿主范围、生长特性、抗生物膜活性及在不同温度和pH条件下的稳定性。结果显示，这些噬菌体属于肌病毒科（Myoviridae）有尾噬菌体目（Caudovirales），分别归入Marfavirus属和Jiaodavirus属。三株噬菌体对58株临床肺炎克雷伯菌中40至43株具有裂解活性（68.97%–74.14%），可感染具有多种荚膜位点（KL）的菌株，包括KL114、KL53、KL8、KL62、KL64、KL124、KL102、KL57、KL39、KL48、KL17、KL20、KL2、KL30、KL51、KL105、KL146、KL28、KL122、KL38、KL3、KL163。基因组分析表明，这些噬菌体基因组大小约170 kb，GC含量约40%，包含超过200个病毒基因；未检测到毒力基因或抗菌药物耐药基因，且缺乏重组酶、整合酶和阻遏物相关基因，符合裂解性噬菌体的基因组特征。生长动力学方面，Kp1Bj_HH11_M23和Kp2Bj_LN294_M23潜伏期为10分钟，Kp10Bj_LN54_14潜伏期为5分钟；裂解量分别为402、2208和119 PFU/细胞；最适感染复数（MOI）分别为10、0.1和0.001。在抗生物膜活性方面，三株噬菌体均显著降低浮游细胞数量并破坏预形成生物膜，48小时生物膜破坏率分别为98.46%、65.56%和99.96%。在稳定性方面，三株噬菌体在pH 3至11范围内稳定，在4至60℃（Kp10Bj_LN54_14为4至50℃）范围内保持活性，高于70℃时丧失裂解活性。这些结果表明，三株贝宁本地噬菌体具有广宿主谱、高裂解量、基因组安全性及较好的环境稳定性，有望作为针对多重耐药和高毒力肺炎克雷伯菌感染的候选噬菌体，并为开发区域性噬菌体疗法提供基础。

3. 主要技术方法概述

本研究的样本包括贝宁Nokoué湖猪场的20份医院污水、15份农民粪便和15份猪粪。以临床多重耐药和高毒力肺炎克雷伯菌为宿主，通过富集培养和双层琼脂法分离噬菌体。利用透射电子显微镜观察噬菌体形态，采用噬菌斑法和效率中心（EOP）测定宿主范围，通过酚-氯仿-异戊醇法提取噬菌体DNA并进行Illumina NovaSeq 6000二代测序。生物信息学分析使用Spades、CheckV、VirSorter2、BLASTn、Cenote-Taker3、Pharokka、Kraken2、Roary和Proksee等工具进行基因组组装、质量评估、注释、分类、系统发育和比较基因组分析。生长特性通过最适MOI测定、吸附试验和一步生长曲线评估。抗生物膜活性在96孔板模型中通过结晶紫染色和菌落计数法评估。稳定性实验在不同温度和pH条件下测定噬菌体滴度。

4. 研究结果分述

（1）噬菌体的分离与形态：从医院污水（Kp1Bj_HH11_M23）、猪粪（Kp2Bj_LN294_M23）和粪便（Kp10Bj_LN54_14）中分离出3株噬菌体。TEM显示它们具有二十面体头部（直径86.67–93.33 nm）和长可收缩尾部（长度约126 nm），呈肌病毒形态。

（2）滴度、宿主范围和EOP：三株噬菌体滴度为7×10⁹至2×10¹⁰ PFU/mL。Kp2Bj_LN294_M23对74.14%测试菌株有裂解活性，Kp1Bj_HH11_M23为70.69%，Kp10Bj_LN54_14为68.97%；它们可裂解多种不同KL型的肺炎克雷伯菌。

（3）基因组比较与系统发育分析：基因组序列登录号分别为PV784030、PV784031和PV784032。基因组约170 kb，GC含量约40%，包含超过200个基因，无耐药或毒力基因。系统发育分析确认3株噬菌体属于肌病毒科，且与已知噬菌体（如vB_Kpn_F48、Marfa、KPV15等）在基因组水平高度相似但存在局部差异。

（4）生长特性：Kp1Bj_HH11_M23在MOI 10时滴度最高，Kp2Bj_LN294_M23在MOI 0.1时最高，Kp10Bj_LN54_14在MOI 0.001时最高。吸附试验显示Kp1Bj_HH11_M23和Kp2Bj_LN294_M23在30分钟完全吸附，Kp10Bj_LN54_14在60分钟仍未完全吸附。一步生长曲线显示潜伏期为5–10分钟，裂解量为119–2208 PFU/细胞。

（5）抗生物膜活性：噬菌体处理组浮游细胞数量较对照组显著下降，且处理组生物膜OD₆₀₀降低。Kp1Bj_HH11_M23在48小时对ST48（KL124）生物膜破坏率达98.46%，Kp2Bj_LN294_M23在24小时破坏率为65.56%，Kp10Bj_LN54_14在48小时对临床菌株14的生物膜破坏率达99.96%。

（6）稳定性：三株噬菌体在pH 3–11范围内稳定，在极端酸性（pH 1–2）或极端碱性（Kp10Bj_LN54_14在pH 12–14）条件下失活。温度稳定性方面，它们可在低温至60℃（或50℃）保持活性，但在70℃以上丧失活性。

5. 讨论与结论总结

讨论部分指出，全球抗菌药物耐药问题在低收入和中等收入国家尤为严峻，非洲缺乏噬菌体疗效数据。本研究中分离的三株噬菌体具有广谱宿主范围，优于一些已报道的噬菌体。其宿主范围广可能与编码多种荚膜解聚酶有关。基因组中无耐药/毒力基因，符合治疗性噬菌体的安全性标准。Kp2Bj_LN294_M23的裂解量（2208 PFU/细胞）高于许多已报道噬菌体。噬菌体通过降解荚膜和多糖基质破坏生物膜，其效果受吸附时间、潜伏期和裂解量等生物学特性影响。所有噬菌体在常见生产和储存条件（4–40℃，pH 4–10）下稳定，表明具有应用潜力。研究局限性包括缺乏与抗生素联用效果、噬菌体耐药出现、体内抗生物膜活性及安全性评估数据；未来需研究噬菌体鸡尾酒疗法和体内疗效。结论指出，这是首次在贝宁分离并表征的肺炎克雷伯菌噬菌体，属于肌病毒科Caundovirales目，具有针对40株以上临床多重耐药和高毒力菌株的裂解活性，基因组不含耐药或毒力基因，结合快速吸附、短潜伏期、高裂解量和强生物膜破坏能力，以及在严苛温度和pH条件下的稳定性，它们可能成为生产和治疗应用的潜在候选者，但仍需进一步研究以推进临床前或临床试验。