《Experimental Hematology & Oncology》：Comparative characterization of OncoPro? and Wnt-based media reveals distinct phenotypic and pharmacologic states in patient-derived tumor organoids
编辑推荐：
背景：患者来源肿瘤类器官（patient-derived tumor organoids, PDTOs）受培养基强烈影响。研究人员比较OncoPro?（OP）Tumoroid Culture medium与常规Wnt/R-spondin/
背景：患者来源肿瘤类器官（patient-derived tumor organoids, PDTOs）受培养基强烈影响。研究人员比较OncoPro?（OP）Tumoroid Culture medium与常规Wnt/R-spondin/noggin（Wnt）培养基；该新近开发的OP培养基为基于Wnt的配方提供标准化、无血清替代方案。方法：研究人员在36株来自多种恶性肿瘤（结直肠、胰腺、乳腺、肺、胃、胃食管交界、胆道、头颈及原发不明）的PDTOs中比较OP与Wnt培养基并评估建立成功率；选取PDTO模型进行下游表征，包括形态学评估、批量转录组分析与公共单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）参考数据集（n=11）比较、全外显子组测序（whole-exome sequencing, WES）（n=9）及33种药物组合的药理学反应谱分析（n=3）。结果：从Wnt培养基适应至OP培养基的成功率为83.3%（15/18），而原代建立更倾向Wnt（33.3% vs 11.1%）。匹配类器官培养中保留关键致癌驱动改变，支持肿瘤相关基因组特征保存。转录组分析证实跨培养基肿瘤身份得以保留，同时揭示不同上皮状态程序：Wnt上调增殖/干性相关基因（如LGR5），OP富集黏附相关基因及炎症/转化生长因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）程序。在scRNA数据库中，OP特征优先映射至胰腺癌恶性上皮区室，而Wnt特征与非恶性上皮相关；类似地，在结肠癌中OP特征主要映射至恶性上皮区室。在胰腺癌和结直肠癌PDTOs（n=3）中进行33种药物筛选显示一致的培养基依赖性变化：在筛选子集中Wnt培养的PDTOs总体更敏感，尤其对丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）轴抑制剂和凋亡增敏剂，而OP培养的PDTOs表现相对耐药。结论：培养基组成是PDTO表型、转录组和药物敏感性的关键决定因素。Wnt培养基与药物敏感状态相关，而OP培养基与黏附及炎症相关程序、33种药物筛选子集中的相对耐药以及在所分析的胰腺/结直肠癌单细胞图谱中与恶性上皮程序更接近相关。
研究背景与问题：患者来源肿瘤类器官（patient-derived tumor organoids, PDTOs）是来源于患者肿瘤样本的三维（three-dimensional, 3D）培养物，可自组装并保留原肿瘤组织学与分子特征，模拟上皮异质性，已用于肿瘤生物学、药物反应和个体化医学。PDTO培养成功高度依赖培养基组成；常规Wnt/R-spondin/noggin（Wnt）培养基含Wnt、Noggin和R-spondin等因子，用于维持干性与自我更新，其中Wnt信号驱动干细胞增殖与维持，R-spondin通过结合LGR5增强Wnt活性，Noggin抑制骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）信号以维持未分化状态。Thermo Fisher Scientific推出的无血清Gibco
? OncoPro
?（OP）Tumoroid Culture medium不含Wnt-3A、R-Spondin、Noggin或小分子抑制剂，提供标准化、无血清替代方案。问题在于OP对PDTO表型、转录组及治疗反应的影响尚未被研究，而培养基可能主动影响肿瘤细胞状态、药敏读数与临床代表性。因此，研究人员在多种肿瘤类型中比较OP与Wnt培养基，评估建立与适应、形态、分子身份、转录状态、单细胞图谱对应关系及药物反应。论文发表在《Experimental Hematology》。研究结论为：培养基组成是PDTO表型、转录组和药物敏感性的关键决定因素；Wnt与药物敏感状态相关，OP与黏附及炎症相关程序、筛选子集中相对耐药及更接近恶性上皮程序相关。其意义在于提示培养基不是被动背景，而是肿瘤细胞状态和临床前药敏推断的主动调节因素，需按实验目的选择并透明报告培养基组成。
关键技术方法（不超过250字）：样本队列来源于Antwerp University Hospital（UZA）手术或胸腹腔穿刺样本，经知情同意，并通过Biobank@UZA获取；共纳入36例多癌种患者。关键技术包括：PDTO建立及Wnt至OP的立即/逐步适应实验；形态学与免疫组化；批量RNA测序；全外显子组测序（WES）及变异/克隆突变分析；公共胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）和结直肠癌（colorectal cancer, CRC）scRNA-seq图谱整合与AUCell基因集评分；33种药物高通量高内涵筛选，采用归一化类器官生长率（normalized organoid growth rate, NOGR）和曲线下面积（area over the curve, AOC）分析；Meso Scale Discovery多因子细胞因子检测。
研究结果：患者队列和样本概览：通过36例患者样本分析，队列以消化系统恶性肿瘤为主，包括PDAC（n=12）、CRC（n=8）、胆管癌（n=4）、胃食管交界癌（n=2）、胃癌（n=1）等，多数为腺癌且多数未接受治疗，结论为队列覆盖多癌种但各亚型样本量有限。原代建立与适应成功率：通过18例原代建立和18例Wnt至OP适应比较，OP适应成功率为83.3%（15/18），立即转换仅少数耐受，逐步转换（25%–50%–75%–100%）使多数恢复生长；原代建立Wnt为33.3%、OP为11.1%，仅两株在两者均成功、无仅OP成功者；OP早期扩增较大但不转化为更高长期建立率；非小细胞肺癌OP培养仍未克服非恶性上皮过度生长。结论为OP更适合已建Wnt系适应，原代建立仍以Wnt占优。形态学差异伴肿瘤分子身份维持：通过11株匹配PDTO形态与WES分析，Wnt培养物多呈黏附、圆滑形态，OP培养物更不规则、皱褶、异质；谱系标志物保留，匹配亲本、OP与Wnt培养物主要突变谱一致，CRC018在两种培养基中均高度一致；PDAC154亲本FFPE与PDTO间KRAS/TP53差异可能反映肿瘤纯度、空间异质性或FFPE检测限制。结论为形态不同但肿瘤分子身份总体保留。OP和Wnt培养基诱导不同转录状态而保留肿瘤身份：通过11株匹配PDTO批量RNA-seq，样本主要按患者聚类而非培养基；差异表达基因比例较低；Wnt上调增殖基因及LGR5、LRIG1等Wnt反应性干性调控因子，OP上调CEACAM6、COL17A1、AMIGO2、AHNAK2等上皮/黏附相关基因；癌症干细胞（cancer stem cell, CSC）相关特征总体保留；基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）显示OP富集干扰素-α（interferon-α, IFN-α）、IFN-γ和TGF-β信号，严格阈值下仅IFN-α保留；细胞因子检测显示OP补充剂含高水平总TGF-β，活性TGF-β仅在OP培养中出现，IL-15存在于补充剂，IP-10（CXCL10）和IL-8（CXCL8）在OP中积累更高但未按细胞量归一化，属探索性。结论为培养基不改变肿瘤谱系身份而施加不同转录状态，OP伴炎症/TGF-β相关程序。OP上调基因优先映射至患者单细胞图谱中的恶性上皮程序：通过PDAC（3对）和CRC（4对）匹配PDTO差异表达及公共scRNA-seq图谱投影，PDAC中OP上调特征主要映射至恶性上皮，尤其经典型，基底样 intermediate，非恶性腺泡/导管上皮低；Wnt上调特征与恶性上皮低而与非恶性腺泡/导管群体一致；CRC中OP上调CEACAM5、CEACAM6、SERPINB5等上皮/上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）相关标志，Wnt上调LGR5、LRIG1、SMOC2等祖细胞标志；AUCell评分显示OP特征在CRC恶性细胞中富集更明显。结论为OP相关状态更接近所分析图谱中的恶性上皮程序，PDAC分析因样本少属探索性。培养基以患者和药物类别依赖方式改变药物反应：通过转录组特征预测及5株匹配PDTO药筛（其中2株OP培养扩增差被排除，最终n=3）进行33药高内涵筛选，药物反应层次聚类主要按培养基而非细胞系分离；OP与Wnt的NOGR-AOC中度正相关，Wnt总体AOC更高即更敏感；ASTX029、trametinib、birinapant在Wnt中细胞死亡更高，docetaxel位移小，顺铂/奥沙利铂曲线平坦；ΔAOC（Wnt?OP）在MAPK轴抑制剂和birinapant中偏正，紫杉类、5-FU、伊立替康接近零；OP培养物在筛选子集中相对耐药，尤其MAPK抑制剂；实验反应与CTRPv2/GDSC转录组预测不完全一致，可能反映细胞系与类器官系统差异。在培养基转换实验中，PDAC138由Wnt转OP再转回Wnt、CRC018由OP转Wnt后，药敏谱呈转移诱导的独立分支，平均在转回Wnt后敏感性增加，提示培养基诱导的上皮状态转换而非以不可逆克隆选择为主，重复实验一致性高。结论为Wnt支持更敏感状态，OP诱导相对耐药且至少部分可逆。
讨论总结与结论翻译：讨论指出，PDTO应用增加，既往研究已显示培养基影响形态、转录组和药敏，但OP对PDTO表型与治疗行为的影响此前未研究。本研究表明两种上皮类器官培养基在保留患者及肿瘤类型总体转录和基因组身份的同时施加不同上皮状态；Wnt至OP转换成功率与既往报道相近，而原代建立率低于Paul et al.报道的约50%；超过90%基因在培养基间未差异表达。Wnt与筛选子集中多个药物敏感性增强相关，OP与黏附重塑及TGF-β信号相关程序及PDAC/CRC中广谱耐药相关，尤其MAPK轴和凋亡靶向治疗，这与Raghavan et al.报道的最小培养基PDTO更耐药一致。药敏在换液后可逆，研究认为主要机制为动态、培养基依赖的肿瘤细胞状态，而非不可逆敏感亚克隆丢失，但不能排除细微选择。OP相关炎症/TGF-β程序的可能机制为OP补充剂中潜伏TGF-β在培养中被激活，但原文未确定具体机制。OP补充剂含总TGF-β和IL-15，对癌相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblast, CAF）和自然杀伤（natural killer, NK）细胞共培养有潜在影响，细胞因子结果因未归一化而属探索性。GDSC/CTRP预测与类器官实测不完全一致，反映永生化细胞系与3D类器官在克隆选择、结构、微环境和外源信号上的差异。Su et al.认为5-氟尿嘧啶、伊立替康等标准化疗的类器官敏感性证据较强，而这些药物在本数据中对培养基依赖较小；靶向治疗则显示较强培养基依赖，历史类器官引导试验可能在不能反映患者肿瘤状态的培养条件下筛选靶向药。研究建议按实验目的选择培养基，并透明报告细胞因子和生长因子内容；局限包括各亚型样本量小、细胞因子仅一株CRC、OP配方未完全公开、长期稳定性未广泛评估、成功模型选择偏倚、肿瘤纯度未量化、药物浓度范围及缺乏与患者结局配对等。研究结论翻译：培养基组成是PDTO上皮状态的重要、可控驱动因素，并直接影响药理学读数。跨肿瘤类型，OP与Wnt培养基保留肿瘤来源身份和致癌驱动，但施加不同转录程序。在PDAC和CRC中，Wnt培养基以更广的药物敏感性为特征，而OP诱导炎症信号程序并与恶性程序一致；OP培养基与PDAC和CRC中相对耐药相关，尤其对MAPK轴和凋亡靶向药物。这些功能差异在换液后可逆，支持状态可塑性而非固定克隆选择。将平行OP和Wnt培养基筛选与患者结局相联系的前瞻性研究、在每种培养基下扩展共培养系统（如CAF、NK细胞）以及敏感性变化的机制解析，可能提高类器官引导精准肿瘤学的可靠性和临床效用；认识并控制培养基诱导的可塑性对稳健的转化推断至关重要。
