《Molecular Genetics and Genomics》：Candidate DNA methylation markers for gestational diabetes: findings from technical and biological validation in a South African population
编辑推荐：
妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus, GDM）会增加母体和胎儿不良结局的风险。利用全基因组BeadChip芯片阵列，研究人员先前报道了GDM女性中1046个CpG位点的差异甲基化。本研究旨在于一个独立的南非GDM与非GDM
妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus, GDM）会增加母体和胎儿不良结局的风险。利用全基因组BeadChip芯片阵列，研究人员先前报道了GDM女性中1046个CpG位点的差异甲基化。本研究旨在于一个独立的南非GDM与非GDM女性队列中验证三个候选CpG位点。在孕周<28周时采集母体外周血，评估位于钙调蛋白结合转录激活因子1（Calmodulin Binding Transcription Activator 1, CAMTA1）、Kelch结构域蛋白3/雄性增强抗原1（Kelch domain-containing protein 3/Male-Enhanced Antigen 1, KLHDC3/MEA1）以及集合素亚家族成员10（Collectin Subfamily member 10, COLECT10）基因内的三个最显著CpG位点的DNA甲基化水平，采用重亚硫酸盐焦磷酸测序法，分别在技术验证组（12例GDM和12例非GDM）和独立生物学验证组（46例GDM和135例非GDM）中进行。同时评估了差异甲基化CpG位点与母体临床特征之间的关联。技术验证证实，GDM女性中cg23643951（CAMTA1；-1.53倍；p=0.04）和cg21910650（KLHDC3/MEA1；-1.57倍；p=0.004）甲基化水平降低，而cg16306629（COLECT10；4.5倍；p=0.003）甲基化水平升高，这与原始芯片阵列发现一致。在生物学验证组中未观察到显著差异。在技术验证组内，cg21910650甲基化与空腹血糖（rho=-0.625；p=0.015）及1小时口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test, OGTT）（rho=-0.555；p=0.034）呈负相关，而cg16306629与空腹血糖呈正相关（rho=0.709；p=0.006）。技术验证确认了三个CpG位点的差异甲基化，但这些发现在更大的独立生物学验证组中未得到重现，凸显了在独立队列中进行验证的必要性。CpG甲基化与葡萄糖浓度的关联表明其可能与妊娠期糖调节存在潜在联系，为未来将这些CpG位点作为GDM生物标志物进行验证奠定了基础。
研究背景与目的
妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus, GDM）是指妊娠期间首次发现的糖耐量异常，全球约16%的妊娠受其影响，且在非洲地区患病率约为10.4%。GDM会增加母体发生子痫前期、剖宫产以及远期发展为2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus, T2DM）和心血管疾病（cardiovascular disease, CVD）的风险，子代也面临巨大儿、新生儿低血糖以及未来肥胖和代谢紊乱的风险。因此，寻找可靠、可及的早期生物标志物对于GDM的及时管理和干预至关重要。表观遗传学机制，特别是DNA甲基化，已被证实在包括GDM在内的代谢疾病病理生理中发挥作用。然而，尽管已有多种族人群的全基因组甲基化研究，但非洲人群的相关数据仍然严重缺乏。研究人员此前在南非GDM女性的外周血中发现了1046个差异甲基化的CpG位点，本研究旨在从中选取三个最显著的候选位点，即cg23643951（位于CAMTA1基因内）、cg21910650（重叠KLHDC3/MEA1基因）和cg16306629（邻近COLECT10基因调控区），在一个独立的南非女性队列中进行技术和生物学两阶段的验证，并探讨这些位点的甲基化水平与母体临床特征的关联。
关键技术方法
研究人员从一项在南非约翰内斯堡初级医疗诊所开展的前瞻性队列研究中选取参与者，所有受试者在孕<28周时入组，均为自我报告的黑人种族、HIV阴性、单胎妊娠、年龄18至40岁。GDM诊断依据国际糖尿病与妊娠研究组（International Association of the Diabetes and Pregnancy Study Groups, IADPSG）标准，于孕24至28周通过75g 2小时口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test, OGTT）确诊。DNA提取自入组时（孕<28周）采集的外周血。针对三个候选CpG位点设计特异性引物，采用重亚硫酸盐焦磷酸测序（bisulfite pyrosequencing）技术对DNA甲基化水平进行定量检测，该技术被视为甲基化定量的金标准。统计分析采用非配对t检验或Mann-Whitney检验比较组间差异，Spearman相关性分析评估甲基化与临床参数的关系。
研究结果
参与者特征
技术验证组包含12例GDM和12例非GDM女性，按年龄、体重指数（body mass index, BMI）和孕周进行了匹配，两组间无显著差异。生物学验证组包含46例GDM和135例非GDM女性，两组在年龄和BMI上无差异，但GDM组的孕周显著低于非GDM组（p=0.035）。技术验证组中，GDM女性的空腹血糖（p<0.001）和1小时OGTT血糖（p=0.006）均高于非GDM组。生物学验证组中，GDM女性的随机血糖（p<0.001）、1小时OGTT（p<0.001）、2小时OGTT（p<0.001）和糖化血红蛋白（glycated hemoglobin, HbA1c）（p=0.015）水平更高，脂联素浓度更低（p=0.043）。
候选CpG位点的差异甲基化验证
通过焦磷酸测序成功优化了三个CpG位点的检测。技术验证确认了GDM女性中cg23643951（CAMTA1）甲基化水平降低（-1.53倍；p=0.040）和cg21910650（KLHDC3/MEA1）甲基化水平降低（-1.57倍；p=0.004），以及cg16306629（邻近COLECT10）甲基化水平升高（4.5倍；p=0.003），这与原始全基因组芯片结果一致。然而，在独立的生物学验证组中，三个CpG位点的甲基化水平在GDM与非GDM组间均未观察到统计学显著差异。
差异甲基化CpG位点与参与者特征的关联
在技术验证组中进一步分析了差异甲基化位点与临床参数的关系。结果显示，cg21910650（KLHDC3/MEA1）甲基化水平与空腹血糖（rho=-0.625，p=0.015）及1小时OGTT血糖（rho=-0.555，p=0.034）呈显著负相关；而cg16306629（邻近COLECT10）甲基化水平与空腹血糖呈显著正相关（rho=0.709，p=0.006）。
讨论与结论
讨论部分指出，技术验证的成功确认了先前全基因组发现的可靠性，但生物学验证的失败则揭示了GDM表观遗传生物标志物研究中的常见挑战。未能重复的原因可能包括：原始发现阶段采用的显著性阈值较宽松（未经假发现率校正），导致部分阳性发现可能是假阳性；技术验证组与生物学验证组在样本匹配程度上的差异，后者具有更大的异质性（特别是孕周差异）；以及Illumina EPIC BeadChip芯片与焦磷酸测序两种平台间的技术差异，尽管两者总体一致性良好，但在单个位点的小幅度甲基化差异上可能出现不一致。尽管如此，研究人员仍观察到了两个位点甲基化水平与血糖指标之间的显著关联，这提示这些CpG位点可能参与妊娠期的糖代谢调控。
结论：本研究在技术验证组中确认了三个候选CpG位点cg23643951（CAMTA1）、cg21910650（KLHDC3/MEA1）和cg16306629（COLEC10）的差异甲基化，与前期全基因组发现一致。然而，这些甲基化差异在包含更多南非GDM女性的独立生物学队列中未能重现，凸显了在独立队列中进行验证的必要性。KLHDC3/MEA1和COLEC10甲基化与血糖浓度的关联表明其可能与妊娠期糖调节存在潜在联系，为未来验证cg23643951、cg21910650和cg16306629的DNA甲基化作为GDM生物标志物的临床实用性奠定了基础。
