伊立替康诱导肠道萎缩并损害十二指肠运动功能与黏膜通透性：体内与体外实验评估

《Cancer Chemotherapy and Pharmacology》：Irinotecan induces intestinal atrophy and compromises duodenal motility and mucosal permeability: in vivo and in vitro evaluations

　　

摘要 目的：肠道毒性是伊立替康（Irinotecan，IRT）化疗的主要不良反应，目前缺乏有效的预防性治疗手段。本研究评估了IRT对（i）十二指肠运动功能和黏膜屏障功能的影响，（ii）小肠及结肠的组织病理学改变，以及（iii）粪便含水量变化，旨在加深对IRT诱导肠道损伤的理解，并为未来治疗策略的开发提供支持。 方法：研究人员对麻醉的Sprague–Dawley大鼠进行原位十二指肠灌流，以量化静脉注射（i.v.）IRT对十二指肠运动功能及3H-甘露醇（paracellular通路）血液至肠腔清除率的影响。在独立实验中，通过腹腔注射（i.p.）IRT诱导肠道毒性。给药72小时后处死大鼠，收集小肠和结肠进行组织病理学评估，同时测定体重和粪便含水量。此外，研究人员在HCT116细胞中检测了IRT及其活性代谢物SN-38对细胞活力的影响。 结果：静脉注射IRT（60 mg/kg）在给药后立即显著增加十二指肠运动功能（+277%）和黏膜旁细胞通透性（+85%）。给药72小时后，腹腔注射IRT（180–200 mg/kg）使十二指肠（?52%，?45%）和空肠（?37%，?33%）的绒毛长度显著缩短，但对回肠无显著影响，同时增加空肠隐窝深度（+48%，+41%）。此外，腹腔注射IRT使粪便含水量升高（+19%，+16%）并降低体重（?10%，?13%）。体外实验中，IRT和SN-38以浓度依赖性方式降低HCT116细胞活力，其IC??值分别为19.4 μM和12.8 nM。 结论：IRT增加十二指肠运动功能，破坏黏膜屏障完整性，诱导腹泻，并造成小肠损伤。SN-38表现出显著更高的细胞毒性效力。这些发现为IRT诱导肠道毒性的机制提供了见解，并可能为制定减轻癌症患者胃肠道不良反应的策略提供参考。

伊立替康诱导肠道损伤机制研究解读：从急性十二指肠功能紊乱到延迟性小肠形态学改变

一、研究背景与科学问题

化疗诱导的肠道毒性是肿瘤治疗中一个亟待解决的临床难题。伊立替康（Irinotecan，IRT）作为喜树碱的半合成衍生物，是治疗结直肠癌、胃癌、胰腺癌和卵巢癌等多种恶性肿瘤的关键化疗药物。然而，其临床应用受到剂量限制性毒性的严重制约，尤其是胃肠道并发症。据统计，40%至100%接受IRT治疗的患者会出现腹泻，其中慢性或严重腹泻不仅可能导致剂量减量和治疗中断，显著降低患者生活质量，甚至可能构成生命威胁。尽管IRT的肠道毒性已被广泛认知，但现有止泻药物仅能提供有限的缓解效果，这凸显了深入理解其潜在机制的必要性。

IRT是一种前体药物，需经体内羧酸酯酶（carboxylesterases，CES1和CES2）及丁酰胆碱酯酶水解为活性代谢物SN-38才能发挥抗肿瘤作用。SN-38通过抑制拓扑异构酶I（Topoisomerase I，Topo1）诱导DNA链断裂，最终触发分裂细胞凋亡。值得注意的是，人羧酸酯酶2（hCE2）在小肠、结肠和肝脏中高表达，其中十二指肠上皮表达水平最高。然而，尽管十二指肠具有如此高的酶活性，SN-38在该肠段的具体效应此前尚不明确。

十二指肠近端上皮细胞以高速率分泌碳酸氢盐以保护黏膜免受酸性胃内容物侵害，这一过程与胰腺分泌共同建立近乎中性的肠腔内环境，对消化酶激活至关重要。此外，肠腔内pH值可能影响某些药物的稳定性。IRT及其活性代谢物SN-38以内酯型和羧酸盐型之间存在pH依赖性平衡，而只有内酯型具有抗肿瘤活性，因此即使pH值的微小变化也可能改变IRT和SN-38的药代动力学和治疗效果。同时，十二指肠上皮旁细胞通透性的正常调节对黏膜屏障功能至关重要，可防止有害肠腔物质通过该途径进入组织和体循环。

既往研究虽已报道IRT可导致肠道杯状细胞减少、黏蛋白分泌改变以及肠神经系统损伤，但对IRT给药后十二指肠运动功能和黏膜屏障功能的急性动态变化缺乏系统研究。基于上述背景，本研究旨在探讨IRT给药是否引起大鼠十二指肠功能改变，以寻找减轻癌症患者肠道毒性的潜在靶点。具体研究目标包括：（a）表征静脉注射IRT对十二指肠黏膜通透性和运动功能的急性影响；（b）表征腹腔注射IRT 72小时后对小肠和大肠上皮形态学及粪便含水量的剂量相关影响；（c）监测IRT和SN-38暴露期间细胞活力的变化。

二、研究设计与技术方法

研究人员采用雄性Sprague–Dawley大鼠（体重250±50 g，购自丹麦Taconic公司）作为实验模型，所有动物实验均经瑞典乌普萨拉当地动物伦理委员会批准并遵循ARRIVE指南。研究主要采用以下几项关键技术方法：

原位十二指肠灌流模型：麻醉大鼠后行气管切开术，经股动脉和股静脉插管，结扎胆总管以防止胰胆液进入十二指肠，建立十二指肠节段原位灌流系统。通过连续监测肠腔内压评估十二指肠运动功能，以压力曲线下面积（AUC）量化运动活性。采用3H-甘露醇血液至肠腔清除率评估十二指肠黏膜旁细胞通透性，该方法可实时、连续监测上皮屏障功能变化。

组织病理学评估：腹腔注射IRT（180或200 mg/kg）72小时后处死动物，采集十二指肠、空肠、回肠和结肠组织，经福尔马林固定、石蜡包埋、切片及苏木精-伊红（H&E）染色后，使用ImageJ软件进行绒毛长度和隐窝深度的形态计量学分析。

粪便含水量测定：收集结肠内容物，经干燥后计算含水量百分比，作为腹泻程度的定量指标。

体外细胞活力检测：将HCT116人结直肠癌细胞暴露于不同浓度（0.001–100 μM）的IRT和SN-38 48小时，采用刃天青（resazurin）还原法检测细胞活力，计算半数抑制浓度（IC??）。

三、主要研究结果

3.1 急性效应：静脉注射IRT对十二指肠功能的影响

在对照动物中，120分钟实验期间十二指肠黏膜旁细胞通透性保持稳定（起始0.74±0.11，结束0.73±0.07 ml·min?1·100 g?1）。静脉注射IRT（60 mg/kg）后，十二指肠旁细胞通透性立即且持续增加，从基线0.76±0.12显著升高至1.37±0.24 ml·min?1·100 g?1（P<0.01），增幅约85%。

在运动功能方面，对照组十二指肠运动功能在实验期间略有下降（从301±99降至73±35 AUC·10 min?1，差异不显著）。而IRT给药后运动功能即刻显著增强，从172±87增至648±212 AUC·10 min?1，并在给药后60分钟内持续上升至最大值733±269 AUC·10 min?1（P<0.01），增幅约277%。在实验最后30分钟，运动功能恢复至与基线无显著差异的水平（208±80 AUC·10 min?1）。此外，IRT给药引起平均动脉血压短暂下降约10–15 mmHg，持续5–10分钟后稳定在略低于基线值的水平。

3.2 延迟效应：腹腔注射IRT 72小时后肠道形态学改变

组织病理学评估显示，单次腹腔注射IRT（180 mg/kg或200 mg/kg）72小时后，十二指肠绒毛高度从对照组的529±23 μm分别显著降低至253±16 μm和289±5 μm（P<0.0001），降幅分别为52%和45%。空肠绒毛高度从对照组的420±16 μm分别降至266±17 μm和282±16 μm（P<0.0001），降幅分别为37%和33%。IRT两个剂量组均显著增加空肠隐窝深度，从对照组的126±9 μm分别增至187±13 μm和178±7 μm（P<0.01），增幅分别为48%和41%。然而，IRT对回肠绒毛高度、回肠隐窝深度及结肠隐窝深度均无显著影响。十二指肠隐窝深度也未发生显著变化。

3.3 腹泻指标：粪便含水量与体重变化

给药72小时后，IRT（180 mg/kg）和IRT（200 mg/kg）组大鼠结肠粪便含水量分别从对照组的68±1.1%显著升高至81±1.9%和79±3.4%（P<0.01），增幅分别为19%和16%。同时，IRT治疗组大鼠体重分别下降10.1±1.9%和12.5±0.7%，而对照组体重增加6.8±0.4%，差异显著。

3.4 体外细胞毒性：IRT与SN-38的浓度-效应关系

在HCT116细胞中，IRT和SN-38均以浓度依赖性方式降低细胞活力，计算所得IC??值分别为19.4 μM（IRT）和12.8 nM（SN-38）。这一结果表明，IRT的活性代谢物SN-38在体外系统中的细胞毒性效力约为IRT的1000倍，是更有效的细胞增殖抑制剂。

四、讨论与结论

本研究首次在高度动态的体内模型中证明IRT及其活性代谢物SN-38诱导肠道生理学的独特且相互关联的效应，将IRT对十二指肠运动功能和黏膜屏障功能的急性影响与延迟性结构损伤及粪便含水量增加联系起来。研究发现，IRT给药后数分钟内即引起十二指肠黏膜旁细胞通透性和运动功能显著增加，这一急性效应此前未见报道。72小时后观察到主要局限于近端小肠的绒毛萎缩，这可能与十二指肠上皮具有高水平的羧酸酯酶2活性，能够将前体药物IRT代谢为活性物质SN-38有关，加之局部pH环境可能有利于IRT和SN-38内酯型的转化。

关于通透性增加的机制，研究人员推测IRT和/或快速形成的SN-38可能直接或间接影响肠上皮细胞内信号通路，导致细胞间黏附改变。体外实验证实SN-38具有约1000倍于IRT的细胞毒性效力，支持上皮损伤参与体内十二指肠通透性增加的假说。然而，由于细胞培养与体内实验是两种完全不同的实验系统，无法从这些数据建立直接的机制联系。

在运动功能方面，IRT诱导的十二指肠运动功能增强几乎在注射后5分钟内即发生。既往研究提示IRT可通过抑制乙酰胆碱酯酶诱导急性胆碱能综合征，升高的乙酰胆碱水平可能通过刺激毒蕈碱受体引起肠道运动功能障碍。然而，研究人员此前在同一实验模型中证明，特异性毒蕈碱激动剂氯贝胆碱并不影响十二指肠运动功能，这提示IRT诱导的运动功能改变机制可能更为复杂，涉及不同肠段和受体亚型的差异。

研究结论：IRT增加十二指肠运动功能，破坏黏膜屏障完整性，诱导腹泻，并造成以近端小肠为主的结构损伤。SN-38表现出显著更高的细胞毒性效力。这些发现为IRT诱导肠道毒性的机制提供了新的见解，特别是十二指肠作为IRT肠道毒性关键靶点的作用，可能为制定减轻癌症患者胃肠道不良反应的临床策略提供参考。未来研究需进一步明确IRT和SN-38在不同肠段的相对贡献、重复给药的影响以及肿瘤模型中的反应差异，并建立前体药物和活性药物的全身及局部组织暴露与效应之间的浓度-效应关系。