3-苯氧基苯甲酸（3-PBA）通过增强人心肌钠通道Nav1.5晚钠电流并延迟失活恢复损害动作电位去极化

《Cardiovascular Toxicology》：The Pesticide Pyrethroid Metabolite 3-Phenoxybenzoic Acid (3-PBA) Impairs Human Cardiac Nav1.5 and Action Potential Depolarization

　　

摘要专业翻译 拟除虫菊酯类杀虫剂（PYRs）在全球范围内广泛使用，其主要代谢产物3-苯氧基苯甲酸（3-PBA）作为人类暴露于PYRs的近乎普遍存在的生物标志物。尽管流行病学数据一致地将尿液中3-PBA与心血管代谢风险及冠心病风险增加相关联，但其直接潜在心脏毒性的潜在电生理机制仍未得到探索。母体PYRs已知通过增强晚钠电流（INa-L）并诱导心律失常而发挥心脏毒性作用，但3-PBA对心脏兴奋性的直接影响此前尚未被研究。本研究表明，3-PBA与在人胚胎肾（HEK293）细胞中表达的人心肌Nav1.5通道相互作用，并以浓度依赖性方式显著增加INa-L，其半数有效浓度（EC50）为51.3 ± 5.1 μM。该代谢产物不改变激活和失活的电压依赖性，但显著延迟峰钠电流从失活状态的恢复。在人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（CM-hiPSCs）和成年大鼠心室肌细胞中，3-PBA降低了最大去极化速率（dV/dt），表明去极化动力学受损且峰钠电流减少。在器官水平，离体大鼠心脏的急性暴露未显著改变标准心电图参数。总体而言，这些发现表明3-PBA并非电生理惰性物质，而是直接调节心脏钠通道功能，尽管其作用浓度超过生理水平。这为3-PBA的生物活性提供了新证据，并提示其心脏毒性潜力在高剂量和慢性暴露条件下或易感人群中可能具有临床相关性。

论文解读

一、研究背景与目的

拟除虫菊酯类杀虫剂（PYRs）约占全球杀虫剂市场的25%–40%，因其高效且被认为对哺乳动物具有较低的急性和慢性毒性，已在农业、家庭和公共卫生应用中很大程度上取代了有机磷和氨基甲酸酯类化合物。PYRs经吸收后在肝脏中通过羧酸酯酶和细胞色素P450酶迅速代谢，产生多种代谢产物并主要通过尿液排出。其中，3-苯氧基苯甲酸（3-PBA）是最常见且被广泛使用的PYRs暴露特异性生物标志物。全球生物监测研究一致报告了人类普遍暴露于PYRs：北美和欧洲普通人群中超过70%可检出3-PBA，中国某些农村地区儿童中检出率超过99%，且儿童尿中浓度常高于成人。

流行病学证据持续将环境暴露于PYRs（以尿中3-PBA评估）与心血管代谢风险增加相关联。基于美国国家健康与营养调查（NHANES，1999–2014）的横断面分析显示，尿中3-PBA浓度与肥胖（尤其女性）、糖尿病以及心血管疾病（CVD）和冠心病（CHD）患病率显著正相关。尿中3-PBA最高三分位数组的个体与最低组相比，现患CVD的比值比（OR）为1.58（95% CI 1.12–2.23），CHD的OR为1.75（95% CI 1.17–2.61），且呈现明显剂量-反应趋势。中国人群中也报道了类似发现，3-PBA最高三分位数组的个体CHD风险显著升高（OR 3.62；95% CI 1.48–8.88）。

尽管流行病学证据日益增多，但3-PBA心血管效应的分子机制仍不清楚。母体PYRs已知通过作用于心脏主要电压门控钠通道（VGSC）Nav1.5，破坏失活过程并产生持续性钠电流成分（即晚钠电流I_Na-L），从而诱发心律失常。然而，3-PBA对心脏兴奋性的直接影响此前从未被研究。此外，斑马鱼胚胎-幼鱼模型研究显示，3-PBA可诱导心包水肿、降低心率、抑制心脏发育并下调心室肌球蛋白重链（vmhc）基因表达，提示其直接干扰心脏形态发生和功能。基于以下考虑——心肌细胞表达对动作电位（AP）起始和传导至关重要的VGSC（主要为Nav1.5）；PYRs的主要靶点为VGSC；3-PBA的结构特征；环境3-PBA水平与CVD/CHD风险增加的反复流行病学关联；以及实验模型提示3-PBA的潜在心脏毒性——研究人员决定评估3-PBA是否直接与心肌钠通道Nav1.5相互作用并调节AP特性和心脏兴奋性。

二、研究内容与主要结论

本研究通过多层面实验体系系统评估了3-PBA对心脏电生理的影响。在分子层面，利用瞬时转染人Nav1.5的HEK293细胞，研究人员发现3-PBA以浓度依赖性方式显著增强I_Na-L（EC₅₀ = 51.3 ± 5.1 μM），且该效应在洗脱后几乎完全逆转；3-PBA不改变Nav1.5激活和稳态失活的电压依赖性，但显著延迟峰钠电流从失活状态的恢复（主要影响慢恢复时间常数τ2）。在细胞层面，成年大鼠左心室心肌细胞暴露于1 μM和30 μM 3-PBA后，动作电位幅值和静息膜电位不变，但最大去极化速率（dV/dt）显著降低；人诱导多能干细胞来源心肌细胞（CM-hiPSCs）暴露于1 μM 3-PBA后，动作电位幅值显著降低且dV/dt显著减少。在器官层面，离体大鼠心脏急性暴露于1 μM和30 μM 3-PBA后，心率、P波时程、PR间期、QRS时程和QTc间期均无显著改变。这些发现表明，3-PBA并非电生理惰性物质，而是直接调节心脏钠通道功能，尽管其有效浓度超过生理水平；其心脏毒性潜力可能在高剂量和慢性暴露条件下或易感人群中具有临床相关性。

三、主要关键技术方法

研究人员采用了以下关键技术方法：全细胞膜片钳技术（patch-clamp）用于记录HEK293细胞中表达的Nav1.5宏观钠电流（I_Na）以及大鼠心室肌细胞和CM-hiPSCs的动作电位（AP）；人胚胎肾293（HEK293）细胞异源表达系统用于表达人Nav1.5 α亚基；人诱导多能干细胞（hiPSCs，ACP5系，Pluricell）通过Wnt信号调控方案定向分化为心肌细胞（CM-hiPSCs），分化第90天后用于电生理实验；成年雄性Wistar大鼠（6–8周龄）左心室心肌细胞酶解分离；Langendorff离体心脏灌注系统结合心电图（ECG）记录用于评估整体心脏电生理参数。

四、研究结果

3-PBA增加I_Na-L并延迟I_Na-peak失活恢复。 在表达人Nav1.5的HEK293细胞中，3-PBA（1至300 μM）以浓度依赖性方式增加I_Na-L，在30 μM时增加约2.3倍，在300 μM时增加约5.5倍，EC₅₀为51.3 ± 5.1 μM，洗脱后效应几乎完全逆转。3-PBA（50 μM）不改变I_Na-peak激活和稳态失活的电压依赖性（V_a、k_a、V_h、k_h均无显著变化），但显著延迟I_Na-peak从失活状态的恢复，主要表现为慢恢复时间常数τ2显著增大。

3-PBA对大鼠左心室和CM-hiPSCs动作电位的影响。 在大鼠左心室心肌细胞中，1 μM和30 μM 3-PBA不改变动作电位幅值和静息膜电位，但显著降低最大去极化速率（dV/dt），表明去极化动力学受损且涉及钠通道参与；APD10、APD50和APD90均无显著变化。在CM-hiPSCs中，1 μM 3-PBA显著降低动作电位幅值和dV/dt，而APD90无显著改变，表明3-PBA损害人心肌细胞去极化动力学而不显著影响晚期复极化。

离体大鼠心脏心电图参数。 离体大鼠心脏急性暴露于1 μM和30 μM 3-PBA后，心率（RR间期）、P波时程、PR间期、QRS时程、QT间期和QTc间期均无显著变化，表明急性暴露于3-PBA在健康离体心脏中不产生明显的心电图改变。

五、讨论与结论总结

讨论部分指出，3-PBA在一般人群中的尿液浓度通常处于纳摩尔范围，但职业暴露的农业工人和急性意外或故意中毒个体中血液和组织水平可达微摩尔浓度，与本研究最低有效测试剂量（1 μM和30 μM）重叠。此外，3-PBA作为亲脂性代谢产物，优先分配至富含脂质的细胞膜和心脏组织微域，局部组织蓄积可导致有效微环境浓度远超可溶性血清水平。与母体PYRs相比，3-PBA对Nav1.5的调节效力低约100至1000倍——母体化合物如β-氟氯氰菊酯和溴氰菊酯在纳摩尔浓度即可快速增加I_Na-L，导致动作电位延长、触发活动和明显心律失常，而3-PBA仅在≥30 μM时才对I_Na-L产生显著增强。研究人员还讨论了HEK293异源表达系统与功能性心肌细胞之间差异的可能原因，包括记录膜电位的差异（HEK293中保持电位为?120 mV，确保完全去除失活；而完整心肌细胞静息膜电位约?80至?85 mV，此时相当比例的Nav1.5通道处于稳态失活状态）以及天然心肌细胞中Nav1.5与辅助β亚基、锚蛋白G等支架蛋白和脂质微域动态相互作用的缺失。此外，研究人员提出不能排除大鼠心肌细胞和iPSC-CMs中观察到的效应部分归因于神经元型钠通道亚型（如Nav1.1、Nav1.2和Nav1.6）的可能性，因为3-PBA及其相关PYRs衍生物对神经元Nav亚型具有显著更高的药理亲和力。

研究结论：3-PBA直接调节心脏钠通道功能并损害动作电位去极化动力学，尽管其有效浓度超过生理水平。该研究首次提供了3-PBA直接作用于人心脏Nav1.5通道的电生理学证据，表明3-PBA并非电生理惰性代谢产物。其心脏毒性潜力可能在高剂量和慢性暴露条件下或易感人群中（如携带SCN5A基因多态性个体）具有临床相关性，为理解环境拟除虫菊酯暴露与心血管疾病风险之间的流行病学关联提供了机制层面的新见解。