水稻OsGTL1启动子编辑通过定向降低气孔密度提高瞬时水分利用效率

《Plant Cell Reports》：Promoter editing of OsGTL1 improves instantaneous water use efficiency via targeted stomatal reduction in rice

关键信息：OsGTL1启动子修饰可降低气孔密度（SD），且与野生型相比该性状呈隐性遗传。较低的气孔密度提高了水分利用效率，但降低了产量构成要素。 摘要：GT2-LIKE1（GTL1）是水稻中预测的干旱响应基因，参与气孔发育调控，然而其与推定靶基因如Stomatal Density and Distribution 1（SDD1）之间的调控关系仍较为复杂。本研究采用基于CRISPR/Cas的编辑技术，通过设计基于tRNA的CRISPR系统对GTL1启动子进行诱变，以改变GTL1表达水平，该策略以7个gRNA靶向转录起始位点5′端约1,500 bp区域。研究人员筛选出两个气孔密度降低的启动子编辑株系，并通过与野生型杂交检测其遗传特性，结果表明其为隐性等位基因，该等位基因调控发育中叶片内OsGTL1的低表达，并导致OsSDD1表达呈升高趋势。OsGTL1低表达并未显著影响拟分生组织（meristemoid）的形成，但阻碍了部分保卫母细胞（guard mother cell）完成对称分裂以形成成熟保卫细胞（guard cell）。气孔密度降低并未使光合速率下降，但在正常条件下的分蘖期及干旱胁迫下的生殖期提高了水分利用效率。然而，正常条件下编辑株系的产量构成要素低于野生型，但在生殖期干旱胁迫下，编辑株系产量构成要素的降幅小于野生型。上述研究结果表明，OsGTL1表达的改变可影响气孔发育和水分利用效率，同时揭示了不同水分条件下节水与产量构成要素之间的权衡关系。

论文解读：水稻OsGTL1启动子编辑调控气孔发育与水分利用效率的研究

一、研究背景与科学问题

随着气候变化加剧，极端干旱和高温事件的发生频率预计将显著增加，这对全球水稻供应构成严重威胁。植物通过表皮气孔散失大量水分，气孔因此成为减少水分流失的重要调控靶点。气孔性状是水分利用效率（WUE）的主要决定因素，但气孔调控并非单一机制，而是复杂生理系统的一部分。在保持水稻生产力的同时降低叶片气孔数量，是应对未来气候变化的潜在策略。近年来，CRISPR/Cas9技术的发展为培育气候适应性作物提供了精准的替代方案。然而，单子叶植物中调控气孔发育的复杂调控网络尚未像双子叶模式植物拟南芥那样被充分阐明，这凸显了对候选基因进行深入功能分析的必要性。

在拟南芥中，GT2-LIKE1（GTL1）被鉴定为Stomatal Density and Distribution 1（SDD1）的转录抑制因子，可直接与SDD1启动子结合以调控气孔密度、蒸腾作用和水分利用效率。拟南芥GTL1功能缺失可降低蒸腾作用并提高干旱耐受性，同时维持生物量积累。尽管GTL1在双子叶植物中的功能已被广泛研究，但单子叶植物中的研究仍处于起步阶段。蛋白质组学数据提示OsGTL1是水稻干旱耐受性的关键蛋白之一，但其对气孔发育和生理表现的特定影响尚待探索。因此，研究人员旨在表征OsGTL1在水稻中的功能，探索其是否在单子叶作物中表现出保守或分化的功能，以深化对谷类作物气孔调控的理解。

二、研究内容与主要结论

由于无法获得可育的OsGTL1纯合敲除突变体，研究人员转而采用启动子编辑策略。通过设计基于tRNA的CRISPR系统，以7个gRNA靶向OsGTL1转录起始位点5′端约1,500 bp区域，成功获得多个启动子编辑株系。其中两个编辑株系（1A5和20B13）表现出显著降低的气孔密度，且该性状呈隐性遗传。OsGTL1启动子编辑导致发育中叶片内OsGTL1表达下调，并伴随OsSDD1表达升高趋势。气孔密度降低并未影响光合速率，但显著提高了瞬时水分利用效率。然而，正常条件下编辑株系的产量构成要素低于野生型，但干旱胁迫下编辑株系产量构成要素的降幅小于野生型。该研究揭示了OsGTL1表达调控在气孔发育和水分利用效率中的重要作用，以及节水与产量之间的权衡关系。

三、主要技术方法

研究人员采用CRISPR/Cas9介导的多重基因组编辑技术，利用tRNA加工系统共表达7个gRNA靶向OsGTL1启动子区域。通过农杆菌介导的遗传转化获得转基因水稻株系，并利用Cas9特异性引物进行PCR筛选以获得Cas9-free编辑株系。采用Sanger测序确认启动子区域的突变事件，利用PLACE数据库和FIMO工具分析顺式作用元件和转录因子结合位点（TFBS）的变化。通过实时荧光定量PCR（qPCR）分析OsGTL1和OsSDD1基因表达水平。使用便携式光合作用系统（LI-6400XT）测定光合参数。采用气孔印迹法和共聚焦激光扫描显微镜观察气孔表型和发育过程。通过全基因组重测序和剂量覆盖分析确认编辑株系的基因组完整性。植物材料为水稻（Oryza sativa cv. Kitaake），种植于泰国曼谷朱拉隆功大学植物学系温室。

四、研究结果

1. 1.
   OsGTL1完全敲除导致不育种子

研究人员设计了两种敲除策略：NP01构建体靶向基因第一外显子，NP03构建体采用3个gRNA靶向第一和第二外显子。共培养获得11个NP01独立T1植株和13个NP03 T1植株，但所有T1植株均表现出高度降低的育性，仅产生5-10粒充实种子，且所有T2种子均无法萌发。由于对照构建体产生正常可育的转基因植株，研究人员推测OsGTL1对育性至关重要。

1. 2.
   七个sgRNA用于OsGTL1启动子修饰

研究人员将启动子区域定义为转录起始位点5′端1.4 kb区域，设计7个sgRNA进行靶向编辑。共获得21个再生植株，表现出多样的启动子区域重排。其中1A5A1-A株系包含gRNA-2至gRNA-3间36 bp和gRNA-5至gRNA-6间29 bp的小片段缺失，而1A5A1-B株系包含gRNA-1至gRNA-6间754 bp的大片段缺失。20B9B1-A株系包含gRNA-2至gRNA-6间643 bp缺失，20B13B2-B株系分别包含gRNA-2至gRNA-5间413 bp和gRNA-5至gRNA-6间142 bp的缺失。FIMO分析显示，1A5株系发生广泛的SQUAMOSA-PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE（SPL）基序获得，而20B13株系仅有少量基序获得和丢失。

1. 3.
   OsGTL1启动子修饰改变基因表达

在正常生长条件下，所有编辑株系发育中叶片组织的OsGTL1表达显著低于野生型，而完全展开叶片中表达水平相似。干旱胁迫下，野生型OsGTL1表达显著降低，而编辑株系未出现降低，各基因型间表达水平相似。

1. 4.
   编辑的OsGTL1启动子降低气孔密度

气孔印迹分析显示，野生型旗叶气孔密度约为300-310个/mm2，而编辑株系约为210-250个/mm2。第二叶中编辑株系气孔密度同样显著低于野生型。1A5株系旗叶气孔宽度降低，所有编辑株系第二叶气孔宽度均显著降低。

1. 5.
   野生型OsGTL1启动子在气孔密度表型中显性调控编辑启动子

通过将纯合编辑株系与野生型杂交，F2代分离分析显示，杂合植株株高显著低于野生型且与纯合编辑株系相似，表明编辑启动子在株高调控中呈显性。而气孔密度仅在纯合编辑植株中低于野生型，表明编辑启动子等位基因在气孔密度调控中呈隐性。

1. 6.
   OsGTL1启动子编辑仅影响OsGTL1表达，对OsSDD1表达无显著影响

在F3群体中，编辑株系基部叶鞘组织的OsGTL1表达在正常和干旱条件下均显著下调。OsSDD1转录水平在编辑株系中趋于高于野生型，但未达到统计学显著差异，该趋势与OsGTL1作为转录抑制因子解除OsSDD1抑制的模型一致。

1. 7.
   编辑的OsGTL1启动子影响早期气孔发育

显微观察显示，编辑株系中拟分生组织密度和拟分生组织指数与野生型无显著差异，表明气孔谱系起始基本正常。然而，编辑株系出现大量发育停滞，主要表现为保卫母细胞未能完成对称分裂形成成熟保卫细胞，以及部分拟分生组织细胞未能进行不对称分裂或向保卫母细胞命运转变。

1. 8.
   较低的气孔密度可通过编辑的OsGTL1启动子遗传给后代

F4代纯合编辑群体中，两个编辑株系均表现出气孔密度显著降低，且气孔指数（SI）显著低于野生型。20B13株系表现出气孔增大和周围表皮细胞扩张。

1. 9.
   气孔密度降低通过OsGTL1启动子编辑提高水分利用效率

在分蘖期，编辑株系净光合速率（A）与野生型无显著差异，蒸腾速率（E）显著低于野生型，瞬时水分利用效率（WUE）显著提高15%和14%。在生殖期干旱胁迫下，编辑株系WUE显著高于野生型。

1. 10.
   编辑的OsGTL1启动子影响产量构成要素

F2代中，编辑株系每穗充实粒数减少超过28%，每穗种子总数减少超过40%。F3代正常条件下编辑株系穗长和穗数一致减少，干旱胁迫下编辑株系单株粒重降幅小于野生型。

五、讨论与结论

研究人员首先尝试诱导OsGTL1无效突变，但未能获得可育的敲除株系，推测OsGTL1功能缺失与育性不相容。因此转而采用启动子编辑策略，通过tRNA剪接系统共表达7个sgRNA靶向1.5 kb的OsGTL1 5′区域，该系统在检测的所有转化体中均产生可检测的改变。1A5株系包含约700 bp的大片段缺失，该区域富含与胁迫响应和发育途径相关的推定顺式调控基序，包括GT1核心序列、四个串联CGCG盒、ABRE相关序列以及与DOF、MYB、MYC、GTGA和E-box等关键转录因子家族相关的基序。TFBS基序分析表明，该大片段缺失不仅消除了天然元件，还改变了周围序列背景，导致SPL等推定结合位点的获得。

OsGTL1在野生型发育中叶片中优先表达，而突变株系部分或完全丧失这种优先表达模式，在成熟叶片中反而表现出较高表达。干旱胁迫下，野生型发育中叶片OsGTL1表达下调，与拟南芥中观察到的模式一致。启动子编辑破坏并不同程度改变了OsGTL1的主要调控特征，表明OsGTL1可能具有高度的细胞特异性。

水稻气孔发育的转录调控由高度复杂的网络控制，涉及ERECTA（ER）和TOO MANY MOUTHS（TMM）等质膜定位受体感知胞外信号，通过YODA（YDA）促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联转导信号，最终调控下游主调控基因的活性。OsGTL1作为转录抑制因子，其表达下调可解除对OsSDD1的抑制，进而影响气孔发育进程。编辑株系中气孔密度降低并未影响光合速率，但提高了水分利用效率，这为培育节水型水稻提供了潜在的遗传资源。然而，气孔密度降低与产量构成要素下降之间的权衡关系，提示在实际应用中需根据目标环境条件权衡节水与产量之间的平衡。该研究为理解水稻气孔发育调控网络和开发气候适应性水稻品种提供了重要的理论依据和遗传材料。