《Protoplasma》：Imaging plasmodesmata: studying the connections between plant cells across scales
胞间连丝（plasmodesmata, PD）是植物细胞之间的通道，对多细胞性至关重要：其允许营养物质、植物激素（phytohormones）、RNA以及包括转录因子在内的蛋白质等多种分子进行细胞间运输。PD对细胞间通讯必不可少，并已被证明在发育转变中具有重要作用。PD最初通过光学显微镜被发现。此后，先进成像方法被用于解析PD超微结构、分析其空间分布并探测多种货物的转运。在本综述中，研究人员首先总结用于研究PD的显微技术，重点关注荧光显微镜和电子显微镜（electron microscopy, EM）。随后，研究人员讨论新兴技术和新进展，如相关光电子显微镜（correlative light and electron microscopy, CLEM）、单分子成像和冷冻电子断层扫描（cryo-electron tomography, cryo-ET），这些方法有望推动该领域取得令人兴奋的发现，例如捕获PD处的动态过程并揭示PD结构此前未知的方面。本综述讨论不同技术的优势与局限，以及如何通过组合这些技术以更详细地理解多样化的PD类型、其分布和功能。
Introduction
PD是植物细胞壁中的纳米级细胞间连接，连接相邻细胞质，构成共质体途径，参与营养转移、发育过程和环境响应；可运输蛋白质、激素、RNA和转录因子。PD结构包括质膜（plasma membrane, PM）衬里、中央内质网（endoplasmic reticulum, ER）棒状结构（desmotubule）及PM与desmotubule之间的胞质鞘；常成簇形成pit fields。按发生分为初生PD和次生PD。较大货物主要经胞质鞘，ER腔运输受限；有效尺寸排阻限受胼胝质沉积调控，也有电荷选择性、货物门控和ER-PM栓系蛋白等机制。PD直径约30–60 nm，低于常规光学衍射极限，因此成像技术是理解其结构、分布和功能的关键。本综述聚焦荧光、EM及新兴技术，评估优劣和组合策略。
Traditional light microscopy: discovery of PD and very early studies
1879年Tangl用光学显微镜在Strychnos nux-vomica子叶和胚乳发现连接相邻细胞的胞质丝，后由Strasburger命名为PD。该发现促成细胞间扩散、共质体等概念。但受衍射极限限制，传统光学显微镜无法空间分辨单个PD，早期观察和分析受限。
Electron microscopy based techniques: ultrastructure and distribution of PD
EM用高能电子替代光子，放大倍数可达10
7，1957年首次获得PD图像，提供结构和空间分布信息。EM揭示玉米根尖PD不对称分布：横向界面多于纵向界面，分生组织界面PD密度高于非分裂组织。制样从化学固定、冷冻置换到完全冷冻保存，减少伪影；不同EM模式互补：TEM/ET分析内部结构，SEM调查孔和pit fields分布，cryo-ET解析近天然膜和大分子组织。
Electron microscopy
常规TEM需固定、脱水、树脂包埋和50–100 nm切片，可能改变PM-desmotubule间距、胞质鞘和颈区宽度以及辐条状密度；测量不应假定精确天然尺寸，但相同制备的大样本可比较相对差异。二维投影受PD方向和切片位置影响，分支或相邻孔可能丢失或重叠；连续切片TEM可扩大体积但垂直分辨率有限。重金属染色对比反映重原子分布而非分子边界，可能遮蔽细结构。高压冷冻和冷冻置换改善保存，但玻璃化深度受样品厚度和组成限制。
Transmission electron microscopy and electron tomography for PD imaging
常规TEM适合大量PD的高分辨率结构分析、尺寸和膜间距近似测量、形态区分及丰度和分布定量；通量高于ET；可结合免疫金标记定位胼胝质和PD相关蛋白如PDCB1、PDLP及SUT1蔗糖/H
+同向转运体mRNA。ET通过倾斜系列重建3D体积，减少投影和切片方向歧义，可追踪分支、desmotubule轨迹和孔径/PM-desmotubule间距变化；用于展示胞质分裂后PD的紧密贴合和后期胞质鞘增宽、病毒运动蛋白VP37诱导的PD重塑及漏斗形PD几何建模；ET保留树脂包埋和染色限制，倾斜角度受限导致各向异性分辨率，通量较低。
Scanning electron microscopy for PD imaging
SEM扫描样品表面，放大可达10
6，制样较TEM简单，无需电子透明薄片。SEM用于PD空间分布、孔面积和pit field面积测量，发现C4玉米比C3小麦PD密度高约两倍，并验证荧光pit field标记。场发射SEM/HRSEM/FE-SEM提高分辨率，显示Chara和高等植物PD形态相似及desmotubule。FIB-SEM和SBF-SEM实现毫米/厘米级体积高分辨3D成像；SBF-SEM用于cher1/clt1突变体筛孔缺陷、鉴定韧皮部-柱鞘周细胞漏斗PD及构建定量分析流程；FIB-SEM区分大豆根瘤简单和复杂PD，分析病毒侵染烟草维管组织PD分布和频率。SEM强于映射分布和类型，但需切片或限于表面，连续切片可能低估计数，难以连续追踪穿壁通道。
Cryo-electron tomography for PD imaging
cryo-ET完全避免化学固定、重金属染色和脱水，快速冷冻使水玻璃化，保持近天然水合状态；省略染色，对比直接来自生物材料，减少固定伪影，可结合子断层平均解析大分子复合物。植物组织因细胞大和液泡含水多而玻璃化困难；近期高压冷冻工作流程在约100 μm厚样品实现玻璃化。cryo-ET在小立碗藓PD首次揭示胼胝质诱导的完全孔闭合新模式和desmotubule包被蛋白组装；但密度分子身份不直接可知，需相关荧光、断层形态或遗传编码cryo-ET标签；标签尺寸可能超过胞质鞘5–10 nm宽度而扰动定位。MCTP家族被鉴定为desmotubule包被组装分子基础。cryo-ET对结构异质和可观测PD数量限制平均分辨率；serial lift-out有望扩大体积并同时映射PD类型和解析单个PD结构。
Fluorescence microscopy-based techniques: localisation of key components, protein composition and PD function
激光扫描共聚焦及衍生技术空间分辨率低于EM，但遗传编码荧光标签和活体成像推动PD研究。
Localisation of PD components by fluorescence microscopy
共聚焦显微镜验证PD富集组分中蛋白的定位，可用免疫标记或荧光蛋白（fluorescent protein, FP）融合与已知PD标记（胼胝质或PD蛋白）共定位；由于侧向分辨率约200 nm高于PD直径30–60 nm，荧光puncta对应PD-rich pit fields而非单个PD。过表达和N/C端融合可能造成伪影；PD Index以PD处平均荧光强度与PD外PM平均强度比值量化富集，半自动脚本帮助定义高置信PD蛋白质组。多重荧光成像可同时可视化多个蛋白或染料，光谱拆分或荧光寿命差异实现高阶多重化，有助于原位解析PD分子复杂性并减少扰动。
Analysis of PD distribution using fluorescence microscopy
稳定表达FP标记PD蛋白的转基因植物可用于大片组织pit fields和3D分布可视化，共聚焦可同时覆盖所有界面方向。PDQUANT算法量化PD和分布，发现水杨酸处理拟南芥叶表皮复杂分支PD插入增加。近期利用PDCB1-FP和MorphoGraphX在拟南芥根进行界面特异性定量，3DCellAtlas生成细胞坐标，Moran’s I评估pit field荧光空间自相关和聚类；发现从分生区到过渡区PD pit field分布偏移，与EM/TEM数据一致，bri1-6突变体径向界面PD密度和聚类增加，显示激素信号通路下PD分布可塑性。
Characterisation of symplasmic transport by fluorescence microscopy
共聚焦可可视化和量化货物经PD运输。荧光恢复后光漂白（fluorescence recovery after photobleaching, FRAP）以高激光强度不可逆漂白定义区域，记录邻近细胞荧光分子流入导致的恢复，恢复速率和移动分数分别反映运输快慢和自由程度；但局部蛋白合成可能混淆，光漂白可产生活性氧、热损伤和防御反应，需优化漂白参数和抗氧化剂。传统用移动FP（如GFP）和荧光示踪剂（如CFDA）测PD通透性。光激活/光转换/光开关FP（PA-GFP、DRONPA-s、Dendra2）以较低激光激活，避免漂白损伤，并可解析方向性；FRAP只能表明分子到达而非来源。透明组织或表层细胞最适合。小分子染料<1 kDa敏感读出基础连通性，荧光葡聚糖和遗传编码FP（甚至>100 kDa核糖核蛋白复合物）探测尺寸门控和动态调控；新探针如StayGold、SNAP标签、超灵敏传感器MGlucoMeter和GA-MatryoshCaMP6s可用于代谢物映射；多光子显微镜结合光开关FP减少光漂白和光毒性，适合深层活体成像和单细胞靶向。
Detection of protein-protein interactions at PD with fluorescence microscopy
共聚焦适合活细胞PD蛋白互作。Split FP将候选互作伙伴融合到互补非荧光片段，互作时重构荧光；用于研究synaptotagmins和PDLP5同/异源互作及PDLP1拓扑，但重构准不可逆可致假阳性，过表达可致伪影，需互补验证。荧光共振能量转移（F?rster resonance energy transfer, FRET）是供受体距离<10 nm时无辐射能量转移，效率随距离降低；用于判断蛋白邻近和互作，常用受体光漂白、荧光寿命成像显微术（fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM）或各向异性衰减测量；受体光漂白更具侵入性，FLIM-FRET读供体寿命，用于ACR4/CLV1复合物化学计量和RTNLB3/RTNLB6与PD/ER/PM伙伴互作。各向异性测量可低激光非侵入活体进行，同源FRET揭示CLV1/ACR4同/异源复合物在PM和PD不同。
Improved spatial resolution fluorescence microscopy
Airyscan收集标准共聚焦针孔拒绝的光，提高分辨率和灵敏度，轴向约350 nm、侧向约120 nm，低激光功率温和活体成像；揭示胞质分裂中ER跨越细胞板及YFP-MCTP沿PD通道荧光。结构光照明显微术（structured illumination microscopy, SIM）/3D-SIM用条纹图案照明和计算重建，分辨率约共聚焦两倍，兼容常规荧光报告和染料；在<100 nm分辨率解析PD内ER丝和PD蛋白在颈区与中央腔定位，桥接共聚焦与EM，并可用于固定和活体样品；与EM结合支持MCTP定位及ER-PM栓系功能。
Emerging and future techniques for PD imaging
新兴EM和荧光技术尚未广泛用于PD，但具潜力。
Extending fluorescence microscopy approaches for imaging of PD
晶格光片显微镜（lattice light sheet microscopy, LLSM）用二维光学晶格照明，限制焦平面激发，降低离焦激发和光毒性，时间分辨率10–100 ms/帧；已用于MCTP家族PD蛋白3D成像，可研究PD蛋白活体定位和动态，但限于透明薄样品、工作距离小和穿透低。受激发射损耗显微术（stimulated emission depletion, STED）用第二环形激光束选择性耗尽焦点周围荧光，实时纳米分辨率，无需后处理，~1 s/帧，适合PD组分动态重塑。光激活定位显微术/随机光学重建显微术（PALM/STORM）基于随机激活单分子定位，精度10–30 nm，可量化分子数和分布，但需光开关/光激活染料或蛋白，通常固定样品且慢；Padron2等正开关FP改善光稳定性；常与全内反射荧光（total internal reflection fluorescence, TIRF）结合，在植物活体中仍具挑战。MINFLUX结合STED和PALM/STORM原理，纳米精度可分辨6 nm间距分子，提高时间分辨率，已用于固定和活体组织及驱动蛋白步动观察，但尚未成功用于植物；可用于PD蛋白互作和运输的纳米追踪。扩展显微术（expansion microscopy, ExM）通过各向同性水凝胶膨胀物理放大样品，使常规显微镜观察纳米结构；拟南芥初生根温和消化实现四倍膨胀并解析31 nm单个PD，但细胞壁消化可能改变PD形态、间距或相关结构，需谨慎验证；ExM不适合活细胞且可能损失分子互作。
Correlative light and electron microscopy for PD analyses
CLEM将荧光动态成像与EM超微结构结合。用于关联MCTP4荧光puncta与PD存在及嫁接界面PD形成；先荧光观察再TEM/ET。制样固定方法取决于样品和分辨率，近期用高压冷冻、冷冻置换包埋和150–200 nm切片兼顾共聚焦和EM；以细胞核或叶绿体等天然标志关联。CLEM需固定，不能同时活细胞和超微成像，但可在固定前获取动态信息。量子点兼具荧光和电子密度，但导入植物困难；植物CLEM需高亮度、抗光漂白且兼容固定和EM的探针，如mScarlet3、mNeonGreen、超稳定YFP、SNAP标签或APEX2；biarsenical-tetracysteine系统可实现先活体成像后TEM检测，有望精确定位PD蛋白并保留超微结构。
Single particle imaging and tracking for PD studies
活体植物单分子成像可监测单个生物分子位置和动态；植物细胞结构和光学挑战延缓应用，但HILO、PALM和单颗粒追踪（single particle tracking, SPT）方案及商业显微镜逐渐可及。SPT监测单膜蛋白侧向扩散，与PALM/STORM均依赖纳米精度单荧光团定位，但SPT跟踪时间动态。SPT常配TIRF降低背景，但观察体积限于盖玻片附近薄层，限制到细胞/组织表面；HILO在TIRF和落射荧光间折中，改善信噪比并成像较深层。SPT可研究蛋白靶向PD动态及功能联系；拟南芥PIP2;1显示四种扩散模式、异质性膜微域关联及盐条件下内化调节水通透性；spt-PALM显示REMORIN高度受限扩散并组织为PD功能纳米域。SPT可研究PDLP或MCTP招募、限制、停留和周转，单分子成像可测蛋白组装化学计量（PIP2;1四聚体）和多色互作。直接观察单个货物经单个PD仍是挑战；FRAP、荧光丢失后光漂白和示踪扩散提供共质体连通性定量但推断而非解析轨迹；SPT可跟踪荧光分子但时间分辨率可能不足捕获胞质鞘内快速扩散；荧光相关光谱（fluorescence correlation spectroscopy, FCS）、raster image correlation spectroscopy（RICS）和pair correlation function（pCF）可量化扩散、限制和方向性，GFP等模型货物可起步，比较胞质和PD-rich pit fields扩散参数可提供分子移动性和停留时间信息，但观察体积空间范围限制单个PD归属。
Raman microscopy for PD related studies
拉曼显微光谱（Raman microspectroscopy, RMS）提供化学微环境分子光谱信息，无需荧光标记、固定或制样，可近天然生理条件；可无标记或使用氘、
13C或炔基标记化合物，共聚焦模式时间分辨率合理。RMS已揭示拟南芥根尖水流动时空动态、细胞壁组分和杨树细胞壁木质素变化。RMS可能非侵入分析PD货物通量和不同组织共质体网络运输特性，揭示PD类型或分布对运输影响。受激拉曼散射（stimulated Raman scattering, SRS）利用化学或荧光标签检测天然环境化学基团，已用于活体植物代谢物和小分子药物可视化及炔基蔗糖在活细胞中转运；但蔗糖转运体存在使区分转运体介导和PD介导通量困难。SRS已研究动物细胞膜脂动态，或可研究PD脂质重塑、未知PD组分、脂质对共质体运输影响及脂滴运输作用。
Atomic force microscopy applications for studying PD
原子力显微镜（atomic force microscopy, AFM）具纳米分辨率，可表征形貌、单分子互作和活样纳米力学性质；植物组织应用有挑战，但已用于植物细胞壁成像。AFM与电镜pit fields比较识别PD样结构；结合核磁共振显示胼胝质与纤维素互作，胼胝质吸湿性可能控制PD孔径和细胞壁弹性；结合质谱可研究富固醇和鞘脂微域对PD膜贡献，若在体外纯化PD囊泡上AFM识别拓扑微域、质谱鉴定膜蛋白和脂质谱。AFM植物组织限制包括长期成像需固定且维持活力困难（生物胶可能解决）、粗糙组织成像不清、一般仅表面；已用AFM表征与次生PD形成相关细胞壁性质，测量拟南芥子叶表皮周壁单层刚度及纤维素微纤丝直径，果胶乙酰转移酶突变体细胞壁刚度更高但微纤丝直径更小；结合遗传学和抗体果胶探测支持果胶酯化与丰度导致细胞壁松弛是次生PD形成所需壁延伸前提，并提示细胞壁刚度与PD数量联系。
Conclusion
成像技术从超微组织到活体动态调控推进PD理解。EM在纳米分辨率定义PD结构和多样性，荧光显微实现细胞间运输、蛋白定位和组织尺度PD分布的功能和定量分析；超分辨和先进活细胞成像开始桥接结构与功能。未来新兴和整合策略包括LLSM、CLEM和单分子方法，结合高空间和时间分辨率，推动复杂植物组织中PD功能的多尺度综合理解。需进一步方法创新，尤其活组织PD结构和动态捕获；单分子显微有助PD生物发生中蛋白招募时序；PD分布和结构动态程度、生物和非生物刺激及发育中重塑速度、简单到分支PD转变机制尚不清楚；需比较研究PD密度和空间模式在组织、细胞类型和界面间异质性及调控；PD运输多由集合测量推断，实时直接观察单个PD货物转运作仍是技术挑战；先进活细胞成像对阐明货物靶向、穿越和运输动态调控至关重要。整合不同成像技术数据必要，例如高分辨低体积与低分辨大体积技术协调，结合SBF-SEM、cryo-ET和共聚焦映射可全面理解PD数量、pit field分布和类型；cryo-ET需改进以适用于更多植物组织，拟南芥根等复杂组织是下一步；荧光显微需改进点状结构成像、PSF处理和灵敏探测器以减少光漂白、成像弱信号和长时间活体成像；清除技术需持续优化以保持组织完整性、降低背景和信号衰减及去除伪影；植物组织体积、厚壁和膨压使成像困难，需清除、固定和较大体积安装改进。
