朊蛋白被忽视的核定位：超越细胞膜的核酸结合与相分离功能

《Biophysical Reviews》：Beyond the membrane: the overlooked nuclear localization of the prion protein

　　

尽管朊蛋白（prion protein, PrP）最广为人知的身份是一种通过糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol, GPI）锚定于细胞表面的糖蛋白，且缺乏经典的核酸结合结构域，但越来越多的证据表明，PrP可定位于胞质溶胶和细胞核，并展现出与RNA和DNA分子相互作用的显著能力。研究人员发现，多种核酸已被鉴定为PrP的相互作用伙伴，包括细胞和病毒RNA、基因组和线粒体DNA，以及高度结构化的核酸基序，例如G-四链体（G-quadruplexes）和DNA发夹适配体（DNA hairpin aptamers），它们通常对PrP表现出特别高的亲和力。这些观察结果表明，PrP的核酸结合特性可能是其生物学中被忽视的一部分，对其生理功能和病理作用（包括生物分子凝聚体的形成）具有潜在影响。虽然此类凝聚体可能参与PrP生物活性的时空组织，但它们老化成动态性较低的凝胶状或固体样组装体，也可能导致与朊病毒病发病机制相关的病理性蛋白质聚集。在此，研究人员综述了关于核相关PrP的文献，并讨论了与其核酸结合相关的分子特征。此外，研究人员认为，基于报告核内和核周PrP的显微镜和生化证据，PrP可能具有先前未被充分认识的核功能。研究人员提出，这种未被充分研究的PrP核定位可能源于历史上对膜相关PrP的关注，并呼吁重新关注其潜在的核活性。

从经典转运到核PrP

成熟的细胞PrP是一个由208个氨基酸组成的蛋白质（全长前体的残基23–230），包含一个长的固有无序区和一个α-螺旋富集的球状结构域。全长PrP作为分泌途径前体合成，其靶向内质网（endoplasmic reticulum, ER）的过程由N端信号序列引导。新生PrP从核糖体出现后，其N端信号序列被信号识别颗粒（signal recognition particle, SRP）识别，促进核糖体-新生链复合物靶向ER上的Sec61易位子。后续易位受PrP信号序列特性和额外易位子相关因子的调控，影响PrP ER输入的拓扑结构和效率。在ER腔内，N端信号肽被切割，蛋白质进行早期折叠和翻译后修饰，包括N-连接糖基化和二硫键形成。在C端，GPI附加信号的识别和切割使得糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚得以附着，从而将PrP拴系在ER膜的内腔面。经过ER加工后，PrP穿过高尔基体，其聚糖进一步重塑，产生成熟的无糖基化、单糖基化和双糖基化物种。随后成熟蛋白被递送至质膜，以GPI锚定形式停留在细胞外小叶，并优先与富含胆固醇和鞘脂的脂筏结构域结合。从细胞表面，PrP可通过网格蛋白介导的内吞作用或非网格蛋白依赖途径（包括小窝蛋白/小窝相关途径）被内化，而它与脂筏的结合影响其膜定位及后续通过内吞区室的运输。内化后，PrP仍朝向内吞区室腔，其运输可影响信号传导，并决定蛋白是循环回质膜还是被靶向至溶酶体降解。

除了经典分泌途径，PrP因其中心疏水域与膜相互作用，可在ER运输过程中/之后产生拓扑结构改变的蛋白种类。其中，^CtmPrP和^NtmPrP来自新生多肽链的替代跨膜取向。这些异构体在结构域暴露于胞质溶胶的方式上有所不同：在^CtmPrP中，PrP的N端区域面向胞质溶胶，而在^NtmPrP中，该区域保持在ER腔内。这一差异至关重要，因为PrP的N端结构域是柔性的，含有与多聚阴离子分子（包括核酸）结合相关的富含赖氨酸的碱性簇。然而，由于这些异构体仍与ER膜结合，它们被排除在胞质环境之外。^CtmPrP与病理结果更直接相关，因为升高的^CtmPrP水平与ER应激、细胞死亡和神经退行性表型有关。

CytoPrP指位于胞质溶胶中、膜结合分泌途径组分腔外的PrP形式。CytoPrP的产生可能源于新生PrP向ER的低效易位，这与N端信号肽的有限效率有关。CytoPrP也可能通过ER质量控制系统中错误折叠ER物种的逆向易位至胞质溶胶而产生。无论哪种情况，cytoPrP通常被靶向至泛素-蛋白酶体系统进行降解。然而，在ER应激、蛋白酶体损伤或涉及疾病相关PrP突变体和/或错误折叠PrP物种负担增加的病理背景下，胞质PrP可能逃脱高效的蛋白酶体降解而积累。这一机制对于携带C端结构域提前终止密码子的致病性PrP变体尤为重要。

一旦进入胞质溶胶，cytoPrP可能主要通过其N端区域与RNA和其他多聚阴离子配体相互作用，该区域已被证明能结合核酸并驱动生物分子缩合。值得注意的是，PrP存在于胞质溶胶为其核输入提供了可行途径，无论是通过核定位信号（NLS）介导的主动运输还是被动扩散。PrP中可能存在核定位信号最早由Oesch指出，基于N端短基序中赖氨酸和脯氨酸的富集。最近，一种平行的核靶向机制已被阐明：留在胞质溶胶中且不遵循分泌途径的PrP首先被伴侣蛋白VCP/p97稳定，然后通过importin-β转运入核，该过程依赖于PrP的柔性N端结构域。

实验证据支持生理性PrP核定位

研究表明，在正常生长条件下或各种应激条件（基因毒性应激、铜处理、蛋白酶体抑制）下，小鼠和人类多种细胞系中的内源性PrP或过表达的PrP构建体定位于核内、核膜或核周区域。核定位在转化的癌细胞系中尤其常见，特别是在活跃分裂/增殖的细胞中以及在基因毒性应激下。去除GPI锚（如表达截短的PrP构建体）会促进核进入。无锚PrP持续显示核积累，而全长PrP常显示核周或核膜定位。GPI锚很可能阻止PrP向核运输，因为它被包裹在囊泡和内吞溶酶体中，面向这些细胞器的腔。研究表明，表达GPI无锚PrP的鼠神经母细胞瘤细胞将核PrP浓缩作为一种对抗PrP聚集的细胞机制。核内相对于PrP过量的RNA可防止其聚集并促进通过泛素-蛋白酶体途径清除。此外，PrP与核蛋白如CBP70相互作用，并调节Wnt信号通路。Biogrid数据库显示许多核蛋白被注释为PrP物理相互作用伙伴，例如与mRNA剪接相关的CWC15剪接体相关蛋白同源物，以及核运输和核结构中的关键参与者。

核酸结合及核PrP的假定生理作用

尽管PrP缺乏经典的核酸结合结构域，野生型可溶性重组PrP（rPrP）和PrP^Sc均已在体外被证明能与DNA和RNA高亲和力结合。该领域的一个主要不足是缺乏活细胞中PrP-核酸相互作用的证据。PrP与核酸的相互作用是混杂的，它能结合真核和原核核酸，无论其大小和序列如何，尽管结合动力学和热力学参数不同。重组PrP还能与简单的重复同聚核糖核苷酸相互作用，这些核酸已被报道能促进PrP^C向PrP^Sc的模板辅助转化。值得注意的是，少数成功生成同时具有蛋白酶K抗性和在细胞及小鼠中感染性的重组PrP的研究之一，采用了混合重组PrP、脂质和总肝RNA的连续蛋白错误折叠循环扩增方案。这一发现强调了RNA作为关键辅因子的重要性，可能对结构转换和感染性都至关重要。尽管缺乏经典的核酸结合结构域，已有实验描述PrP至少四个区域参与核酸结合：(i) 残基23–31；(ii) 残基51–90，对应于八肽重复区；(iii) 残基101–110；(iv) C端结构域。此外，N端结构域有两个推测的单分型NLS，它们与前述两个N端DNA结合区域重叠。有趣的是，NLS预测算法NLSExplorer预测了两个NLS基序，其中第一个N端基序与实验测试的NLS-I重叠，而C端基序的功能相关性仍有待验证。进一步的生物信息学分析表明，人PrP结合DNA的预测倾向大于结合RNA，大多数预测的结合残基集中在N端区域，尽管C端结构域也预测有DNA结合残基。