《Discover Medicine》：Aptamers for precision diagnosis and therapy for viral infections and parasitic neglected tropical diseases
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寄生性和病毒性病原体给全球健康带来了沉重负担。早期、准确且经济可及的诊断方法仍然稀缺，能够实现无菌治愈的治疗手段也同样匮乏。为应对这些挑战，适配体（aptamers）被提出作为潜在的替代方案。它们通过构象调控展现出增强的稳定性、成本效益、可规模化生产以及长期储
寄生性和病毒性病原体给全球健康带来了沉重负担。早期、准确且经济可及的诊断方法仍然稀缺，能够实现无菌治愈的治疗手段也同样匮乏。为应对这些挑战，适配体（aptamers）被提出作为潜在的替代方案。它们通过构象调控展现出增强的稳定性、成本效益、可规模化生产以及长期储存而不丧失活性的特点。因此，适配体在生物医学领域被广泛探索，用于被忽视热带病（NTDs）管理中的生物标志物检测、成像、诊断和靶向治疗。近期针对SARS-CoV-2、HIV-1、肝炎病毒、利什曼原虫（Leishmania）、克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）和恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）等病毒靶点的适配体研究显示，其在临床前模型中表现出改善的亲和力、更低的检测限、强效的抑制效果以及增强的治疗效能。基于适配体的生物传感器、荧光检测、磁分离以及纸基侧流层析试纸条（LFAs）所需试剂和设备极少，实现了真正的现场部署能力。核酸酶敏感性、快速肾清除以及规模化生产中的挑战正通过化学修饰加以解决，并通过指数富集的配体系统进化技术（SELEX）加速推进。本综述评估了适配体在病毒性和寄生性NTDs中的当前应用，概述了存在的障碍，并指出了通向临床可行、低成本诊断和治疗平台的路径。
论文主体内容总结
1. 引言
世界卫生组织数据显示，广泛的病毒和寄生虫感染持续威胁着超过10亿人口，主要影响低收入和中等收入国家的人群。尽管从下一代测序（NGS）到侧流层析试纸条（LFAs）等技术取得了显著进步，但被忽视热带病（NTDs）的有效检测和管理仍受到严重限制。传统方法昂贵、劳动密集且可能产生假阳性结果。适配体因其高特异性和亲和力、低免疫反应风险、易于化学修饰、与纳米载体递送兼容以及成本效益高等独特优势，被认为是替代传统诊断和治疗方法的强有力候选者。本综述旨在评估适配体针对复杂病毒、原生动物和蠕虫病原体的应用，重点关注资源受限环境下的低成本即时检测（POCT），并讨论了人工智能驱动的SELEX计算工具以及血清稳定性和供应链物流等转化挑战。
2. 适配体
适配体，也称为化学抗体，是通常由15至100个核苷酸组成的短链单链核酸（DNA或RNA）。其名称源自拉丁语“aptus”（意为“适合”）和希腊语“meros”（意为“部分”）。适配体以锁钥相互作用与特定靶分子结合，具有抗体样的特异性。与传统抗体相比，适配体具有成本效益高、批次间变异小、免疫原性低以及因尺寸较小而组织穿透力更强等优势。适配体由核苷酸A、G、C、T或U组成，因其特定序列和互补性而形成独特的三维结构，如茎环、假结、扭结和凸起。鸟嘌呤四链体（G-quadruplex，G4）结构由富含鸟嘌呤的序列形成，具有热力学稳定性和高抗核酸酶降解能力，适用于治疗试剂或诊断应用。
2.1 通过SELEX进行适配体筛选与开发
最佳适配体通过指数富集的配体系统进化技术（SELEX）识别。该技术由Tuerk和Gold开创，涉及多轮体外筛选、亲和纯化和扩增，从约1012-1015条序列的大型文库中富集高亲和力适配体。筛选过程包括初始文库与靶标的孵育、去除未结合或松散结合的寡核苷酸、洗脱靶标特异性序列以及通过PCR扩增。负筛选阶段用于去除交叉反应和非特异性结合物。传统的SELEX受限于靶标不稳定性和复杂的生物基质，而更新的版本如Cell-SELEX允许在天然环境中筛选适配体。SELEX技术已从需要多轮的经典蛋白质筛选发展到高通量、人工智能辅助和微流控平台。先进的SELEX策略包括硝酸纤维素膜过滤结合法、磁珠法、电泳法、微流控法和微阵列法等。近年来，针对NTDs的应用，如检测利什曼原虫多聚腺苷酸结合蛋白（PABP）和飞摩尔级别检测恶性疟原虫乳酸脱氢酶（LDH），证明了适配体加速临床转化的潜力。
2.2 适配体作为合成抗体
目前，抗体是研究、制药和诊断中最有价值的分子之一。然而，与适配体生产相比，抗体生产更耗时费力，需要免疫活体动物。适配体在分子量、批次间差异、修饰和合成方面优于抗体，具有更高的稳定性、快速的转运能力和更低的免疫原性。适配体在室温下的长期稳定性使其成为即时检测（POCT）的理想候选，特别是在缺乏冷链基础设施的资源有限地区。适配体的小尺寸使其能更好地穿透生理屏障，如血脑屏障。适配体-药物偶联物（ApDCs）为病毒和寄生性NTDs的靶向药物递送提供了有前景的工具，例如通过靶向感染巨噬细胞上的标志物来递送两性霉素B或苯并硝唑等药物。
3. 对新诊断方法的需求
有效的治疗依赖于早期发现和准确诊断。传统的血清学诊断方法如比色测定和培养技术劳动强度大、准确性低且耗时长。酶联免疫吸附试验（ELISA）易出现假阳性和假阴性结果，尤其是在交叉反应普遍存在的地方病流行区。聚合酶链式反应（PCR）技术灵敏度高，但无法确认疾病的无菌治愈，因为DNA在细胞死亡后仍会持续存在于环境中。
3.1 适配体在诊断中的应用
与基于蛋白质的亲和试剂相比，适配体更稳定，周转时间（TAT）更短，有利于即时诊断（POCD）。适配体可通过多种检测形式进行传感，包括荧光、放射性同位素、电化学、光学、比色和酶联测定。除了诊断，适配体还可作为分子阻断剂，抑制蛋白质与其靶标结合，阻碍病毒复制。
3.2 针对病毒的适配体
传染病由细菌、真菌、病毒以及单细胞和多细胞寄生虫引起。病毒的高突变率和感染风险促进了具有流行病甚至大流行潜力的新型变种的出现。适配体可结合参与病毒吸附、穿透、复制、成熟和释放等多个阶段的病毒蛋白。
3.2.1 HIV
针对HIV-1反式激活因子（Tat）蛋白的RNA适配体显示出对TAR RNA高出133倍的结合亲和力，并能抑制Tat依赖的转录反式激活。一项研究采用分支SELEX方法生成了结构多样的适配体，用于分析HIV-1衣壳蛋白（CA）功能。最近，两个单链DNA适配体（Apt1-HCPRp2和Apt2-HCPRp2）被筛选出来，靶向HIV-1蛋白酶的一个交叉反应肽，为基于适配体的共结合诊断提供了概念验证。
3.2.2 SARS-CoV-2
SARS-CoV-2的诊断最初主要依靠RT-PCR、ELISA和LFAs，但由于全球试剂短缺等问题，逐渐转向基于适配体的平台。最常用的靶蛋白是核衣壳（N）蛋白和刺突（S）蛋白。结合机器学习算法，研究人员开发了靶向受体结合域（RBD）的适配体CoV2-RBD-1C和CoV2-RBD-4C。这些适配体被组装成球形中和金纳米颗粒鸡尾酒（SNAP），有效阻断病毒进入。其他研究报道了具有极高检测灵敏度的DNA适配体，达到1×104拷贝/mL。一种名为SNAP1的DNA适配体对刺突蛋白N端结构域的结合亲和力极高（Kd < 80 nM），通过LFAs和ELISA检测紫外线灭活病毒的检测限（LoD）为5×105拷贝/mL。二聚体适配体DSA1N5对Alpha和Delta变体及野生型具有皮摩尔级亲和力，固定在金电极上可在不到10分钟内实现快速电化学检测。此外，一种环状双价单链DNA适配体cb-N-Apt17对核衣壳蛋白表现出优异的稳定性和改进的结合亲和力。
3.2.3 肝炎
首个用于HBV诊断的高亲和力HBs-A22 RNA适配体可特异性结合表达HBsAg的肝癌细胞系HepG2.2.15。随后，针对HBsAg的特异性单链DNA适配体被开发出来，用于构建结合磁分离和免疫测定的适体传感器，在血液样本中检测HBsAg的检测限为0.1 ng/mL。针对丙型肝炎病毒（HCV）包膜糖蛋白E2的单链DNA适配体ZE2显示出高亲和力和特异性，可从患者血清样本中捕获HCV颗粒，并可作为检测E2表达细胞的分子探针。
3.3 针对寄生虫的适配体
寄生虫病对人类健康构成重大威胁，尤其是在欠发达国家、热带和亚热带地区。最近的进展已识别出靶向利什曼原虫（Leishmania）、疟原虫（Plasmodium）和刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）等病原体的适配体。
3.3.1 动质体目
3.3.1.1 锥虫属
首个针对布氏锥虫（T. brucei）的RNA适配体被报道，它能靶向寄生虫的各种表面蛋白，并可作为细胞外寄生虫表面的生物标志物。后续研究表明，该适配体可作为细胞内递送载体，通过寄生虫的内吞机制将RNA偶联化合物递送至细胞内区室。针对布氏锥虫变异表面糖蛋白（VSG）结构域的RNA适配体具有纳摩尔至亚纳摩尔的亲和力。针对克氏锥虫（T. cruzi）锥鞭毛体开发的RNA适配体Apt68表现出强亲和力，解离常数在8-25 nM范围内，其靶标在克氏锥虫中特异性表达。此外，还分离出了针对克氏锥虫感染性锥鞭毛体上不同宿主细胞受体的高亲和力配体，显示出调节或抑制寄生虫入侵途径的潜力。
3.3.1.2 利什曼原虫属
一项研究利用SELEX从组合RNA文库中筛选出含有导入序列基序的适配体，这些短RNA能被导入利什曼原虫线粒体，表现为线粒体输入受体的适配体。另一项研究开发了靶向婴儿利什曼原虫（Leishmania infantum）KMP-11膜蛋白的单链DNA适配体，其特异性通过Western blot、dot blot和ELISA得到证实。
