HSV-1 ICP0表达诱导核内TDP-43聚集体形成

《Journal of NeuroVirology》：HSV-1 ICP0 expression induces formation of nuclear TDP-43 assemblies

　　

含有核RNA结合蛋白TDP-43的毒性胞质聚集体在多种神经退行性疾病中形成；然而，驱动聚集的分子触发因素仍不清楚。流行病学证据已将潜伏和再激活的单纯疱疹病毒1型（HSV-1）感染与神经退行性疾病的发生联系起来，但HSV-1感染是否影响TDP-43的亚细胞分布尚不清楚。在此，研究人员证明，HSV-1感染上皮细胞和背根神经节（DRG）来源的神经元会导致TDP-43在核内重新分布，并在独特的核内聚集体中积累。在这些条件下未检测到胞质TDP-43。核内TDP-43聚集发生在感染早期，并依赖于关键调控基因ICP0的表达。值得注意的是，在未感染细胞中异位表达ICP0足以诱导核内TDP-43聚集。因此，由一个近乎普遍存在的人类疱疹病毒编码的单一病毒基因产物的表达即可改变TDP-43的核内定位。此外，研究人员的工作揭示了疱疹病毒感染与神经元疾病因子错误定位之间潜在的机制联系。

研究背景与科学问题：TDP-43（TAR DNA结合蛋白43）是一种广泛表达的核RNA结合蛋白，参与RNA定位、剪接和降解。正常情况下该蛋白主要定位于细胞核，而胞质聚集和核内耗竭是肌萎缩侧索硬化（ALS）和额颞叶痴呆等多种神经退行性疾病的标志。尽管已知多种翻译后修饰与TDP-43聚集有关，但体内聚集如何起始、哪些分子开关导致异常定位仍不清楚。流行病学证据提示单纯疱疹病毒1型（HSV-1）的潜伏和再激活与神经退行性疾病发生相关，但HSV-1感染是否影响TDP-43亚细胞分布此前未知。研究人员因此系统研究了HSV-1感染对TDP-43胞内定位的影响，并鉴定出关键病毒因子。

研究人员主要使用人视网膜色素上皮细胞ARPE-19和背根神经节（DRG）来源的神经元样HD10.6细胞（由Anna Cliffe惠赠），采用HSV-1 KOS及多种突变病毒（ΔICP0 7134、回复体7134R、ΔICP4 n12、ΔICP8 d301、ΔICP22 d22lacZ，分别来自Neal DeLuca、Steven Rice和David Knipe实验室），结合慢病毒介导的GFP-TDP43表达、多西环素诱导的ICP0表达、免疫印迹、免疫荧光、高内涵成像和共聚焦z-stack体积分析等技术，并利用UV灭活病毒、环己酰亚胺（CHX）和膦酰基乙酸（PAA）处理确定病毒基因表达和DNA复制在聚集体形成中的作用。

研究结果：

HSV-1感染导致核内TDP-43聚集体形成：在ARPE-19细胞感染HSV-1 KOS 9小时后，研究人员通过免疫荧光和z-stack体积分析发现，感染细胞核内TDP-43聚集体体积较未感染细胞显著增大，且未检测到胞质TDP-43重新分布。

TDP-43在HSV-1感染的神经元中形成核内包涵体：在分化后的HD10.6神经元样细胞中感染HSV-1 24小时，同样观察到核内TDP-43聚集体体积显著增加，表明该现象存在于上皮细胞和更接近疾病的神经元样细胞中。

GFP-TDP43重现HSV-1诱导的核内聚集体：研究人员用慢病毒表达GFP-TDP43融合蛋白，在感染细胞中观察到与内源TDP-43一致的核内聚集体增大，且相对增加幅度与内源蛋白相似，排除了抗体依赖性伪影。

核内TDP-43聚集体不富集HSP70蛋白：免疫荧光和荧光强度线扫描显示，HSV-1诱导的GFP-TDP43聚集体内部HSP70信号明显降低，与未被聚集体包裹的周围核区域不同，提示这些结构不同于由TDP-43包裹HSP70形成的anisosome（一种TDP-43环绕分子伴侣HSP70的核结构）。

核内TDP-43聚集体的形成依赖于病毒蛋白合成和ICP0表达：UV灭活病毒和CHX处理完全阻止聚集体形成，说明需要病毒基因表达和从头蛋白合成。PAA抑制DNA复制或ΔICP8病毒感染仍能形成聚集体；ΔICP4感染导致聚集体数量轻度下降，但仍有显著增加；ΔICP22不影响聚集体形成。相比之下，ICP0缺失病毒7134不能诱导核内TDP-43聚集体，而其回复体7134R恢复诱导能力，证明ICP0是HSV-1感染中核内TDP-43聚集体形成所必需的。

外源性ICP0表达足以形成TDP-43聚集体：在多西环素诱导表达ICP0的未感染ARPE-19细胞中，内源TDP-43形成体积显著增大的核内聚集体，证明单独表达ICP0即足以驱动核内TDP-43聚集。

讨论与结论：研究人员指出，HSV-1感染诱导的是核内TDP-43聚集体，而非ALS特征性的胞质聚集。多种病毒可通过不同机制影响TDP-43，如肠道病毒蛋白酶可剪切TDP-43并促进聚集，而HSV-1通过ICP0驱动核内聚集。ICP0的RING finger结构域在α-疱疹病毒家族中高度保守，提示水痘-带状疱疹病毒（VZV）等其他成员可能也存在类似机制。此外，研究人员前期工作表明神经元中TDP-43是HSV-1 ICP0 mRNA剪接和病毒复制所必需的，ICP0与TDP-43之间的功能互作反映了病毒与宿主长期共进化形成的复杂平衡。HSV-1诱导的核内TDP-43聚集体不富集HSP70，也不依赖ICP22，因此不是经典的VICE结构域（病毒诱导的分子伴侣富集结构域），其确切组成以及这些聚集体是保护性还是细胞毒性仍有待确定。研究结论：HSV-1感染上皮细胞和DRG来源神经元可诱导核内TDP-43聚集体形成，该过程依赖病毒蛋白ICP0，且单独表达ICP0即足以诱导；这一发现为疱疹病毒感染与神经元疾病因子错误定位之间提供了潜在机制联系。