慢性神经肽S治疗改善APP/PS1小鼠睡眠结构与Aβ相关病理

《Frontiers in Neurology》：Chronic neuropeptide S treatment improves sleep architecture and reduces Aβ-related pathology in APP/PS1 mice

　　

背景： 睡眠紊乱在阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）中频繁发生。尽管神经肽S（neuropeptide S, NPS）通过广泛表达的NPS受体（NPS receptor, NPSR）促进觉醒，但其在AD相关睡眠失调中的作用尚不清楚。 目的： 研究慢性NPS给药对AD相关睡眠紊乱的影响，超越其急性促觉醒作用。 方法： 研究人员检测了APPswe/PS1dE9（APP/PS1）双转基因AD小鼠模型下丘脑和海马中的NPSR表达。小鼠接受脑室内NPS（1 nmol/天）注射14天。睡眠-觉醒状态被分为觉醒（wakefulness）、非快速眼动（non-rapid eye movement, NREM）睡眠和快速眼动（rapid eye movement, REM）睡眠。研究人员评估了小鼠的睡眠结构和淀粉样蛋白-β（amyloid-β, Aβ）相关病理。在BV2细胞中检测了细胞相关Aβ水平、细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase, ERK）磷酸化和自噬相关蛋白。研究人员还检测了NPS处理的APP/PS1小鼠对后续脑室内Aβ1–42给药的睡眠反应。 结果： APP/PS1小鼠下丘脑和海马中的NPSR蛋白水平低于野生型（wild-type, WT）对照。与生理盐水处理的APP/PS1小鼠相比，NPS处理的小鼠NREM睡眠增加、觉醒减少，且Aβ相关病理降低。睡眠量的变化在光照期最为明显。后续Aβ1–42给药主要在暗期增加觉醒并减少NREM睡眠，同时在光照期缩短NREM睡眠片段。在BV2细胞中，NPS改变了细胞相关Aβ水平并增加了ERK磷酸化。NPS处理还与更高的LC3B-II和更低的p62水平相关。SCH772984减弱了NPS相关的自噬相关蛋白和细胞相关Aβ的变化。 结论： 慢性NPS给药改善了APP/PS1小鼠的睡眠结构并减少了Aβ相关病理。BV2研究结果提示ERK信号和自噬相关过程可能参与细胞Aβ处理。

论文解读：慢性神经肽S治疗对APP/PS1小鼠睡眠结构与Aβ病理的改善作用

一、研究背景与目的

阿尔茨海默病是一种进行性神经退行性疾病，以细胞外淀粉样蛋白-β沉积和由过度磷酸化tau蛋白组成的细胞内神经原纤维缠结为特征，进行性的记忆和认知功能损害严重影响患者的独立生活能力和生活质量。睡眠-觉醒状态包括觉醒、非快速眼动睡眠和快速眼动睡眠三类。睡眠-觉醒紊乱在AD患者中十分常见，包括觉醒、NREM睡眠和REM睡眠的异常，在转基因小鼠模型中也观察到相关睡眠-觉醒异常。睡眠问题在AD病程早期即可出现，遗忘型轻度认知障碍患者已表现出睡眠脑电图异常，包括第2期睡眠纺锤波减少和深NREM睡眠时间缩短。临床上AD的睡眠紊乱包括夜间睡眠碎片化、日间嗜睡和睡眠-觉醒节律改变，较差的睡眠质量还与认知未受损成年人的淀粉样蛋白沉积相关。临床观察与实验发现共同支持睡眠紊乱与AD病理之间存在双向关系的假说，纵向证据表明睡眠紊乱包括失眠症状和睡眠呼吸障碍与后续认知障碍、轻度认知障碍和包括AD在内的痴呆风险增加相关。

神经肽S是一种保守的20个氨基酸神经肽，主要在脑干蓝斑周围核和臂旁核合成，通过激活Gαq偶联的NPS受体发挥功能，NPSR在脑内广泛分布，在杏仁核、丘脑和前额叶皮层密度较高。NPS-NPSR信号轴调节多种神经行为过程，包括通过促进海马长时程增强增强认知、发挥抗焦虑作用，并在睡眠-觉醒周期调节中发挥重要作用。研究人员前期研究显示，14天脑室内给予NPS可减少APPswe/PS1dE9双转基因AD模型小鼠的Aβ沉积并改善认知功能。急性脑室内给予NPS可增加啮齿动物觉醒并减少NREM和REM睡眠，伴随后下丘脑组胺能和食欲素能神经元激活。实验研究支持睡眠-觉醒调节与Aβ病理之间的相互作用，临床研究将碎片化的24小时休息-活动节律与后续更大的Aβ负担和认知衰退联系起来，小鼠实验表明可溶性Aβ寡聚体可破坏睡眠，急性脑室内给予合成Aβ寡聚体可减少NREM睡眠并增加觉醒状态之间的转换。这些观察提出了慢性NPS给药如何影响APP/PS1小鼠睡眠以及睡眠变化是否与Aβ病理变化相关的问题。本研究比较了生理盐水处理的野生型和APP/PS1小鼠的睡眠-觉醒指标，评估了慢性NPS处理对APP/PS1小鼠的影响，并检测了NPS预处理小鼠对后续Aβ_1–42给药的睡眠反应，同时通过BV2细胞实验探索候选细胞机制。

二、主要技术方法

研究人员使用了8月龄雄性APPswe/PS1dE9双转基因小鼠及其野生型同窝小鼠，来源于南京大学模式动物中心。采用立体定位手术植入脑室内套管和脑电图/肌电图记录电极，术后恢复7天后每日脑室内注射NPS或生理盐水14天，随后连续记录24小时睡眠-觉醒活动。睡眠-觉醒状态按30秒epoch通过Spike2睡眠评分脚本结合快速傅里叶变换辅助频谱分析进行视觉评分。采用Western blot检测NPSR、APP、p-APP、Aβ、自噬相关蛋白及信号通路蛋白表达，免疫组织化学检测NPSR阳性细胞，免疫荧光检测4G8阳性Aβ斑块和Iba1阳性小胶质细胞。BV2小胶质细胞系购自武汉普诺赛生命科技有限公司，用于细胞相关Aβ水平、ERK磷酸化和自噬相关蛋白检测，并使用ERK抑制剂SCH772984进行药理学验证。

三、研究结果

3.1 APP/PS1小鼠下丘脑和海马中NPSR表达降低

Western blot显示APP/PS1小鼠下丘脑和海马中NPSR蛋白水平低于WT对照，免疫组织化学分析显示APP/PS1小鼠两个脑区每视野NPSR阳性细胞数减少，生化和组织学测量共同表明所检测的两个脑区NPSR表达降低。

3.2 慢性NPS处理对APP/PS1小鼠NPSR表达和睡眠-觉醒结构的影响

与生理盐水处理的APP/PS1小鼠相比，NPS处理的小鼠下丘脑和海马NPSR水平升高。与生理盐水处理的WT小鼠相比，APP/PS1小鼠在光照期和24小时内觉醒时间更多、NREM睡眠时间更少，光照期和24小时内REM睡眠时间更少，光照期觉醒片段更多、REM片段更少，暗期NREM片段更多，光照期和暗期平均NREM片段持续时间均更短。NPS处理14天后，光照期和24小时内觉醒减少，光照期和24小时内NREM睡眠增加，REM睡眠时间无显著差异；NPS处理小鼠光照期觉醒片段减少、两个时期NREM片段减少、暗期REM片段减少，光照期和暗期平均NREM片段持续时间均延长。

3.3 NPS处理后Aβ相关病理及Aβ_1–42给药后的睡眠变化

生理盐水处理的APP/PS1小鼠下丘脑和海马中APP和p-APP水平高于WT小鼠，NPS处理的小鼠下丘脑和海马中APP和p-APP水平均低于生理盐水处理的APP/PS1小鼠。NPS处理后海马4G8阳性面积百分比降低。在NPS预处理小鼠中，接受Aβ_1–42的小鼠在暗期和24小时内觉醒时间更多、NREM睡眠时间更少，光照期平均NREM片段持续时间更短。

3.4 NPS减少APP/PS1小鼠Aβ斑块负担并改变BV2细胞中细胞Aβ处理和自噬相关蛋白

NPS处理组每视野4G8阳性Aβ斑块数量显著低于生理盐水组。BV2细胞实验中，与Aβ_1–42单独处理组相比，NPS处理1小时后细胞相关Aβ水平显著升高，而0.5、1.5和2小时无显著差异。免疫荧光显示Aβ_1–42加NPS组每视野Iba1/4G8双阳性细胞数高于未处理和Aβ_1–42单独处理组。洗脱实验中，洗脱前Aβ_1–42加NPS组在0.5和2小时细胞相关Aβ水平均高于Aβ_1–42单独处理组，洗脱后24小时两组细胞相关Aβ水平相似。处理24小时后，Aβ_1–42加NPS组LC3B-II/β-actin水平较高而p62/β-actin水平较低。

3.5 ERK抑制减弱NPS相关的自噬相关蛋白和细胞Aβ变化

Aβ_1–42暴露的BV2细胞p-ERK/t-ERK比值低于未处理对照，NPS共处理使p-ERK/t-ERK比值相对于Aβ_1–42单独处理升高，而p-p38/t-p38、p-JNK/t-JNK和p-AKT/t-AKT比值在各组间无显著差异。SCH772984增加了p62水平并降低了LC3B-II/LC3B-I比值，在NPS 100 nM实验中增加了细胞相关Aβ水平。

四、讨论与结论

慢性NPS治疗改善了APP/PS1小鼠的部分睡眠指标并减少了淀粉样蛋白相关病理。与生理盐水处理的WT小鼠相比，生理盐水处理的APP/PS1小鼠觉醒增加、NREM睡眠减少、NREM片段缩短，NPS处理改变了其中部分异常：觉醒减少和NREM睡眠增加主要在光照期，NREM片段在两个时期均延长。这些变化伴随海马4G8阳性面积降低以及下丘脑和海马APP和p-APP水平降低。慢性治疗后的NREM睡眠增加与急性促觉醒反应不同，但治疗持续时间和疾病背景未独立变化，差异原因尚不确定。Aβ_1–42挑战实验显示外源性Aβ_1–42可在NPS处理后改变睡眠，但未建立对NPS反应的特定逆转，且缺乏无NPS预处理的对应Aβ_1–42挑战组，Aβ制剂含DMSO而对照组仅接受生理盐水，无法排除溶剂相关效应。淀粉样蛋白相关病理的减少不能仅归因于小胶质细胞清除，较低的APP和p-APP水平也提示Aβ产生可能改变，睡眠结构变化和其他清除过程也可能有贡献。BV2实验提供了NPS细胞反应的证据，但测量不能区分细胞内摄取与表面相关Aβ、降解改变、释放或细胞密度差异。LC3B-II升高和p62降低与自噬相关过程变化一致，但无溶酶体抑制的终点测量不能确立自噬流增加。p-ERK/t-ERK比值升高和SCH772984效应支持ERK可能参与BV2反应，但ERK抑制不能选择性检验自噬，自噬标记物和Aβ实验使用了不同NPS浓度，未在相同处理条件下直接建立ERK-自噬-Aβ降解序列。此外，缺乏WT加NPS组无法评估慢性睡眠反应是否对APP/PS1模型特异，动物实验限于8月龄雄性，细胞实验使用永生化BV2细胞系而非原代小胶质细胞。结论为慢性脑室内NPS治疗改善了APP/PS1小鼠睡眠结构的选定方面并减少了淀粉样蛋白相关病理，BV2实验提示ERK信号和自噬相关过程可能参与细胞Aβ处理，其体内对NPS睡眠和病理效应的贡献尚待确立。