低强度脉冲超声经TRPV4/Ca2+/eNOS/NO轴恢复淋巴内皮细胞钙振荡并改善冷刺激骨关节炎关节疼痛与积液

《Journal of Orthopaedic Translation》：LIPUS promotes calcium oscillations to improve lymphatic drainage and alleviates cold-stimulated pain and effusion in osteoarthritis joints

　　

背景：骨关节炎（OA）缓解期患者常在冷刺激后出现疼痛和关节肿胀急性加重，这是“冷膝”的特征性临床表现之一。中医中该现象与“寒痹”相关，反映关节内“湿邪留恋”和“气血瘀滞”，并与OA中观察到的滑膜淋巴系统（SLS）功能障碍在概念上一致。然而，冷刺激加重OA的潜在机制及治疗策略仍研究不足。方法：通过内侧半月板失稳（DMM）手术建立OA小鼠模型。术后4周将小鼠暴露于冷刺激，以模拟缓解期OA患者遭受急性冷刺激。采用步态分析和von Frey试验等多种方法评估关节疼痛相关行为。采用磁共振成像（MRI）评估关节积液。采用近红外吲哚菁绿（NIR-ICG）成像和关节腔内注射异硫氰酸荧光素-葡聚糖（FITC-dextran）评估淋巴引流。进一步利用活细胞荧光成像研究温度降低和低强度脉冲超声（LIPUS）对淋巴内皮细胞（LECs）钙振荡及一氧化氮（NO）产生的影响。此外，利用瞬时受体电位香草素4（TRPV4）抑制剂HC-067047探讨LIPUS发挥治疗作用的机制。结果：急性冷刺激加重DMM手术小鼠步态异常并降低缩足阈值。此外，这些小鼠的承重不对称和开放场总运动距离也恶化。急性冷刺激后膝关节积液显著加重，并伴滑膜淋巴引流受损。机制上，冷刺激抑制LECs钙振荡并降低其NO产生，而LIPUS可有效恢复上述变化。此外，LIPUS治疗改善膝关节淋巴引流并缓解小鼠冷刺激加重的OA表型。在TRPV4抑制及后肢淋巴管结扎条件下，这些治疗效应显著受抑。结论：淋巴引流功能障碍参与冷刺激加重的OA表型，LIPUS可通过TRPV4/Ca²⁺/内皮型一氧化氮合酶（eNOS）/NO轴诱导NO产生而缓解该加重。这些发现为“冷膝”机制提供新见解，并突出LIPUS治疗OA疼痛和关节积液的潜力。本文转化潜力：研究人员的研究提示，LIPUS通过改善滑膜淋巴引流缓解OA冷诱导的疼痛和关节积液加重。这些发现为LIPUS在以淋巴引流功能障碍为特征的骨骼疾病中的应用转化潜力提供初步证据。

研究背景与问题：OA是最常见关节疾病之一，表现为关节疼痛、肿胀和活动受限，全球约5.28亿人受累。关节疼痛是患者就医的主要原因。动物研究显示，长期低温暴露可加重OA发病过程，如软骨退变。中医将关节炎称为“痹症”，其中“寒痹”描述冷刺激后关节和肌肉组织出现“湿邪留恋”及“气血瘀滞”，低温妨碍致病因素清除并导致关节疼痛和肿胀。临床上，缓解期OA患者在急性冷刺激后出现疼痛和关节肿胀加重，与“冷膝”特征一致。现代组织学和生理学认为，淋巴管引流组织中的代谢废物、炎症物质和细胞；关节腔内物质经滑膜淋巴孔进入毛细淋巴管，再进入集合淋巴管，由淋巴管平滑肌细胞（LMCs）自发性收缩和邻近骨骼肌外力驱动，最终引流至引流淋巴结（DLN），膝关节主要引流至髂淋巴结（ILN），并经胸导管回流入循环。SLS功能直接决定滑膜免疫微环境稳定性，并通过组织间串话影响关节软骨稳态。活动性OA中，关节积液与滑膜炎和关节疼痛密切相关；免疫细胞、炎症因子、致痛物质和基质降解酶积累加重疼痛，且与SLS功能障碍密切相关。低温抑制淋巴收缩并削弱淋巴引流，为OA患者“冷膝”提供潜在机制。但淋巴引流在冷诱导OA急性加重中的作用及治疗策略仍未充分探索。LIPUS是一种安全、无创的物理治疗方式，主要经机械而非热效应发挥作用，可激活多种机械敏感离子通道，尤其是钙通道。既往研究显示LIPUS在OA治疗中可延缓软骨退变、抑制滑膜成纤维细胞增殖和滑膜纤维化，并可通过TRPV4介导的软骨细胞钙振荡发挥促自噬和软骨保护作用；LIPUS还可通过淋巴引流促进脑实质废物清除。但LIPUS能否促进滑膜淋巴引流并缓解“冷膝”关节疼痛或积液尚不清楚。因此，研究人员提出急性冷刺激通过损害淋巴引流加重OA疼痛和关节积液的假设，并在DMM术后4周建立急性冷刺激模型，以模拟缓解期OA患者的冷诱导急性加重。

研究开展与意义：研究人员在DMM术后4周、具有中度滑膜炎和轻度疼痛的阶段给予急性冷刺激，发现其显著加重OA小鼠疼痛和关节积液，同时伴明显淋巴引流受损；低温抑制LECs钙振荡，参与“冷膝”淋巴收缩功能障碍；LIPUS治疗改善淋巴引流功能障碍，并缓解冷刺激加重的疼痛和积液，相关效应可由恢复TRPV4依赖性钙振荡及随后LECs的NO产生介导。研究揭示SLS在“冷膝”发病中的关键作用，并提示LIPUS改善关节淋巴引流、缓解OA相关疼痛和积液的潜力。

关键技术方法：研究使用12周龄C57BL/6J雄性小鼠（Charles River Laboratory Animal Technology，北京）建立DMM OA模型，术后4周行4 °C冷刺激。采用步态分析、开放场、承重不对称和von Frey试验评估疼痛相关行为；7.0 T MRI评估关节积液。采用NIR-ICG成像及关节腔FITC-dextran示踪评估滑膜淋巴引流、滑膜内流和DLN容量。用活细胞荧光成像检测LECs钙振荡和NO；以TRPV4抑制剂HC-067047及后肢淋巴管结扎进行机制阻断；并给予LIPUS治疗。

研究结果：（1）急性冷刺激加重关节疼痛、积液和巨噬细胞聚集。DMM小鼠4 °C冷刺激后，步态最大接触面积、摆动速度和duty cycle较对侧及室温组下降，开放场总运动距离减少，承重不对称增加、缩足阈值降低；假手术小鼠冷刺激后疼痛相关行为无显著恶化。MRI显示DMM小鼠4 °C组关节积液体积显著大于室温组，假手术组无显著差异。组织学显示DMM小鼠4 °C组F4/80阳性滑膜细胞显著增多，OARSI评分和滑膜炎评分呈升高趋势但未达统计学显著；假手术组组织学无显著差异。结论为急性冷刺激加重OA关节疼痛、积液和巨噬细胞聚集，而对健康关节影响轻微。（2）急性冷刺激损害OA膝关节淋巴引流。NIR-ICG显示DMM小鼠4 °C组关节清除率显著低于室温组；FITC-dextran示踪显示4 °C组滑膜内流显著减少，ILN荧光强度降低，提示DLN容量受损；假手术小鼠冷暴露后滑膜内流和DLN容量也下降，但程度不及DMM小鼠。结论为冷暴露损害健康与OA关节淋巴引流，淋巴引流受损可能是冷诱导OA症状加重的重要参与机制。（3）LIPUS恢复冷抑制的LECs钙振荡。活细胞钙成像显示37 °C组LECs呈活跃钙振荡，33 °C组钙峰数、峰幅度和响应细胞比例显著降低，LIPUS处理可恢复上述指标。结论为LIPUS在体外可逆转冷诱导的LECs钙振荡抑制。（4）LIPUS改善小鼠淋巴引流并缓解冷刺激加重的OA表型。冷刺激DMM小鼠中，LIPUS提高NIR-ICG关节清除率、FITC-dextran滑膜内流和DLN容量；MRI关节积液减少，F4/80阳性滑膜细胞减少，步态异常改善，缩足阈值升高、承重不对称降低；滑膜炎评分呈下降趋势但未达统计学显著，短期软骨基质降解无显著影响；室温下LIPUS除关节积液外多数差异未达统计学显著。结论为LIPUS改善淋巴引流并减轻冷刺激加重的关节疼痛、积液和巨噬细胞聚集。（5）LIPUS通过激活LECs中TRPV4促进钙振荡和淋巴引流。HC-067047抑制TRPV4后，LIPUS诱导的LECs钙振荡显著受抑；LIPUS可提高33 °C条件下eNOS和p-eNOS水平及NO产生，而HC-067047可抑制这些效应。体内给予HC-067047或行淋巴管结扎后，LIPUS改善的关节清除率和DLN容量显著降低，F4/80阳性滑膜细胞增多，LIPUS对步态异常和关节疼痛的缓解作用受抑；各组滑膜炎评分无显著差异。结论为LIPUS经TRPV4介导的LECs钙振荡促进淋巴引流，并据此缓解冷刺激加重的OA表型。

讨论总结与研究结论：讨论指出，冷暴露对关节炎具有显著影响，临床和动物研究均提示OA对寒冷敏感；本研究进一步揭示短时冷暴露损害淋巴引流，是冷刺激加重OA疼痛和关节积液的重要但非唯一参与机制。冷暴露未在正常关节引起明显疼痛或步态异常，提示淋巴引流受损单独可能不足以引发明显疼痛，但可与较高水平促炎介质等致痛物质协同，加重已患病OA关节症状。滑液稳态由毛细管滤过、滑膜分泌和淋巴引流共同控制，淋巴引流清除多余液体和大分子；本研究中急性冷刺激下淋巴引流受损促进OA关节积液，但短时冷暴露也可能增加关节炎模型膝关节血流，因此积液增加可能还涉及滑膜液产生增加。淋巴自发性收缩是淋巴引流的基本机制，eNOS/NO维持正常淋巴舒张-收缩节律；LEC产生的NO扩散至LMCs并通过cGMP信号调节舒张，钙信号是eNOS磷酸化激活的关键调节因素。TRPV4为温度敏感离子通道，在LECs而非LMCs高表达，并参与温度调节淋巴内在收缩性和淋巴流；LIPUS诱导的钙激活呈延迟反应，提示其可能依赖钙信号级联和累积效应。研究提示LIPUS可通过TRPV4/Ca²⁺/eNOS/NO轴改善冷刺激下淋巴收缩-舒张节律并促进淋巴引流。讨论还指出，淋巴引流功能障碍在骨骼疾病发病中具有作用，改善SLS功能可减少老年小鼠OA组织损伤，人工淋巴引流可减轻全膝关节置换术（TKA）后早期下肢水肿和疼痛；LIPUS作为安全无创治疗已用于促进骨折愈合和伤口修复，本研究提示其可考虑用于其他伴淋巴引流功能障碍的骨骼疾病，如异位骨化和运动损伤所致水肿。局限性包括：DMM模型为创伤诱导OA，不同于年龄相关自发性OA；冷刺激为全身性而非局部，不能排除其他组织或器官影响、神经敏化及交感神经激活所致血管收缩和滑液产生增加；仅使用雄性小鼠；LIPUS也可能通过直接镇痛或减少巨噬细胞炎症因子等非淋巴引流途径缓解疼痛；短期冷暴露结果能否外推至长期冷暴露尚待确定。研究结论翻译：淋巴引流功能障碍促进冷刺激加重的OA表型，LIPUS通过TRPV4/Ca²⁺/eNOS/NO轴诱导NO产生可缓解该加重；这些发现为“冷膝”机制提供新见解，并突出LIPUS治疗OA疼痛和关节积液的潜力。