骨软骨-滑膜离体关节共培养模型的构建与优化：葡萄糖与氧气条件对关节组织维持及代谢影响的系统评价

《Journal of Orthopaedic Translation》：Establishing a functional osteochondral–synovial ex vivo joint model: Systematic evaluation of glucose and oxygen impact

　　

背景： 骨软骨-滑膜离体（ex vivo）共培养模型是研究关节生物学与疾病机制的前沿平台，其能够捕捉关键的组织间相互作用，包括骨-软骨串话（crosstalk）及滑膜炎症调控。然而，由于离体关节模型中最佳葡萄糖与氧气水平缺乏共识，该类模型的推广应用仍受到限制。本研究旨在探讨培养基中葡萄糖浓度及培养过程中的氧气供应如何影响复杂骨软骨-滑膜离体共培养模型中组织的维持与代谢活性，以期确定适合开展组织间相互作用、炎症与退变反应可控研究以及人体组织验证前候选疗法临床前评估的最佳培养条件。 方法： 研究人员自牛膝关节（stifle joint）获取骨软骨外植体及滑膜组织，于静态共培养体系中维持7天。培养分别在高糖（HG，4.5 g/L，超生理浓度）或低糖（LG，1 g/L，生理浓度）杜氏改良 Eagle 培养基（DMEM）中进行，并置于高氧（21% O2）或生理氧（5% O2）条件下。各组织独立评估组织反应，检测指标包括细胞活力、糖胺聚糖（GAG）与一氧化氮（NO）释放量、组织学分析、基因表达谱及非靶向代谢组学。 结果： 与HG培养基相比，LG培养条件增加了软骨深层及软骨下骨区域的细胞死亡。基因表达与代谢组学分析揭示了各组织对葡萄糖和氧气的特异性反应。在软骨和骨中，葡萄糖驱动的转录及代谢变化在高氧条件下发生，但在生理氧条件下基本消失。在滑膜中，亦观察到基因对葡萄糖和氧气的特异性敏感性；然而，葡萄糖依赖的代谢反应在生理氧条件下持续存在。 结论： 本研究对软骨、软骨下骨和滑膜中葡萄糖与氧气组合的系统评价表明，生理氧条件下使用HG培养基最能维持组织活力并稳定分子反应，尤其在骨软骨组织中表现突出。这些发现为优化静态离体关节模型、提高其可重复性与转化价值提供了循证指导。 本文的转化潜力： 本研究确立了牛骨软骨-滑膜离体共培养模型的优化培养条件，提升了该模型在组织反应可控研究及人体模型验证前药物与生物材料临床前筛选中的转化相关性。

论文解读

一、研究背景与意义

离体外植体模型处于简化体外（in vitro）系统与复杂体内（in vivo）动物研究之间的独特位置。通过保留天然细胞外基质（ECM）架构并维持真实的细胞-细胞及细胞-基质相互作用，该类模型能够捕捉单层培养乃至先进三维（3D）构建体（如微球或类器官模型）中丢失的生物学特征。在关节软骨再生领域，离体模型已被广泛用于新兴疗法的功能评估；在骨关节炎（OA）研究中，这些系统更发挥着核心作用，允许研究软骨退变、构建可控的疾病样环境，并辅助治疗候选药物的预筛选。由于OA影响全球数亿患者且至今缺乏疾病修饰治疗手段，在机制相关系统中评估治疗反应具有重大临床意义。

为构建更准确反映体内关节生物学、增强临床前发现转化价值的离体环境，一种策略是将骨软骨外植体与滑膜组织结合。骨软骨外植体已优于单纯软骨模型，因为软骨下骨的存在显著改变了炎症和分解代谢信号并改善软骨细胞存活，可能通过释放骨源性介质实现。纳入滑膜组织进一步增强了模型的生理相关性，近期研究已证明滑膜组织巨噬细胞（STMs）构成免疫保护性衬里屏障，可调节关节炎症并可能控制炎性关节疾病（如类风湿关节炎）的进展或缓解。滑膜炎症与OA疼痛和进展密切相关，因此纳入滑膜可模拟单纯软骨外植体无法捕获的临床相关炎症通路。

尽管这一整合的骨软骨-滑膜模型为复杂离体关节模型提供了坚实基础，该领域仍缺乏标准化方案。这一缺口在葡萄糖可用性和氧气浓度这两个基本培养参数的界定上尤为突出。所有三种关节组织均在显著降低的氧气条件下运作，软骨氧梯度从浅表区约6%降至深层区低至1%；骨和滑膜等血管化组织氧水平介于5%至12.5%之间。软骨、骨和滑液中的生理葡萄糖浓度（约5 mM，约0.9 g/L）显著低于标准高糖（HG，4.5 g/L，约25 mM）培养基中的水平。然而，不同研究在采用生理条件（低糖LG约5 mM葡萄糖和5% O₂生理氧）或非生理条件（约25 mM葡萄糖和21% O₂高氧）时，关于组织代谢及其体外维持得出了相互矛盾的结果。这些不一致性阻碍了临床前研究的可重复性，限制了离体发现向临床转化的进程。鉴于离体关节模型最佳培养条件缺乏标准化方案和数据驱动的指导，本研究在复杂牛骨软骨-滑膜共培养模型中系统评估了葡萄糖浓度（LG DMEM对比HG DMEM）与氧气供应（高氧对比生理氧）的联合效应，旨在确定能维持关节组织活力和细胞表型的培养条件，为未来使用离体模型的关节研究提供循证建议。

二、主要技术方法

研究人员从当地屠宰场获取牛膝关节（3雄2雌），自股骨滑车采集圆柱形骨软骨外植体（直径8 mm，高6 mm），并以活检打孔器自同一关节获取滑膜组织盘（直径8 mm），共培养7天。实验采用四种条件组合：高糖（HG，4.5 g/L）或低糖（LG，1 g/L）DMEM，配合高氧（21% O₂）或生理氧（5% O₂）。主要技术手段包括：乳酸脱氢酶（LDH）/乙锭同源二聚体-1（EthHD1）及钙黄绿素AM/EthHD1染色结合显微镜成像评估细胞活力；实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）检测各组织基因表达；二甲基亚甲基蓝（DMMB）染料法测定GAG释放、Griess试剂系统测定NO释放；番红O/固绿组织学染色评估形态与蛋白多糖分布；液相色谱-质谱联用（LC-MS）非靶向代谢组学分析组织代谢谱；以及培养基中葡萄糖消耗和乳酸产生的定量测定。

三、研究结果

3.1 细胞活力： 在软骨中，LG条件下深层区域（约1100-1400 μm）细胞死亡显著增加，且该效应与氧气水平无关；HG条件下全层软骨细胞活力保持高于95%，而LG条件下活力取决于软骨厚度，厚样本（>1500 μm）在5% O₂下活力降至37-46%。在软骨下骨中央区，HG在5% O₂下活力显著高于LG（50%对18%）；外缘区LG在两种氧条件下均显著降低细胞活力。滑膜组织细胞活力不受葡萄糖或氧气水平影响，各条件下均保持80%以上。

3.2 GAG与NO释放： 7天培养期间，GAG和NO的累积释放量不受葡萄糖浓度或氧气张力显著影响。番红O/快绿染色的组织学定性评估未显示不同培养条件间蛋白多糖表达的明显差异。

3.3 各关节组织基因表达： 在软骨中，HG在21% O₂下上调ACAN、COL10、ADAMTS4、MMP13和IL6表达，但5% O₂下这些葡萄糖依赖性差异消失；GLUT1和GLUT3在LG下上调且5% O₂进一步增强其表达。在软骨下骨中，ALPL受氧气显著调控而对葡萄糖不敏感；VEGF在LG加5% O₂条件下显著上调；GLUT1在HG下下调，GLUT3和GLUT4呈现条件依赖性变化。在滑膜中，ADAMTS5在LG下于两种氧条件均下调，MMP1在5% O₂下于两种糖条件下均下调，IL6在HG加21% O₂下上调，GLUT3和GLUT4呈现葡萄糖依赖性差异。

3.4 各关节组织代谢组学： 主成分分析（PCA）显示新鲜组织与培养7天组织间清晰分离。在软骨中，21% O₂下HG与LG呈现适度分离，5% O₂下无聚类；在骨中，21% O₂下HG与LG沿PC2清晰分离，LG组内氧气水平间呈现强分离；滑膜显示最强的葡萄糖驱动效应，HG与LG在两种氧水平下均形成不同聚类。显著差异代谢物数量有限（软骨5-7种、骨8-14种、滑膜7-11种），主要包括葡萄糖、葡糖胺、葡糖酸、尿嘧啶、cAMP、次黄嘌呤、4-吡哆酸及多种嘌呤代谢物。通路富集分析提示嘌呤代谢、维生素B6代谢及多种氨基酸生物合成可能参与氧气反应，但均未达FDR校正后的统计显著性。葡萄糖消耗和乳酸产生在HG培养中显著高于LG，且5% O₂下HG与LG间的差异较21% O₂减弱。

四、讨论与结论

讨论部分指出，LG条件下软骨深层和软骨下骨中央区细胞死亡增加，反映了静态培养体系中生理葡萄糖浓度不足以满足组织高代谢需求，原因包括离体软骨下骨缺乏血液供应、静态培养无法复现体内滑液约每2小时更新的动态过程，以及LG培养基中约84%的葡萄糖在换液间被消耗殆尽。HG培养基通过维持更高的扩散浓度梯度支持组织葡萄糖通量和细胞代谢需求。5% O₂生理氧条件可缓冲或抵消葡萄糖介导的转录和代谢反应，使LG与HG条件下的基因表达和代谢谱趋于一致，提示葡萄糖可用性与生理氧通路之间存在交互作用。各组织对葡萄糖和氧气的反应呈现组织特异性：软骨中HG在21% O₂下诱导分解代谢、肥大及炎症基因，滑膜中IL6呈现与软骨相似的模式，而MMP1和ADAMTS5呈现不同调控模式，反映了滑膜异质性细胞组成。葡萄糖转运蛋白（GLUT1、GLUT3、GLUT4、GLUT5）的表达受葡萄糖和氧气水平联合调控且呈组织依赖性，体现了细胞对营养环境波动的适应性调节。代谢组学揭示生理氧条件下维生素B6代谢的氧依赖性调控及嘌呤代谢的组织特异性变化。研究局限性包括供体数量有限（n=3-5）、所有组织共用同一培养基、单一氧气张力（5% O₂）应用于所有组织、仅评估7天培养期以及牛组织与人体的物种差异。

研究结论表明，葡萄糖浓度和氧气供应以组织特异性的方式调节关节组织的稳态和代谢。在当前测试条件下，高糖培养基最适合维持软骨和软骨下骨的活力，而滑膜对其代谢环境变化表现出更高的敏感性。生理氧条件（5% O₂）有助于缓冲软骨和骨对营养波动的反应，支持更稳定和生理相关的代谢状态。建立此类功能性培养条件对于开发具有临床意义的离体平台、减少对动物模型的依赖以及加速OA和其他关节疾病的转化研究至关重要。