他克莫司通过调控血管重塑改善肺纤维化相关肺动脉高压

《Frontiers in Pharmacology》：Tacrolimus ameliorates pulmonary hypertension associated with pulmonary fibrosis via modulation of vascular remodeling

　　

摘要 引言： 特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）常合并肺动脉高压（pulmonary hypertension，PH），即IPF-PH，这是一种严重病症，可加重症状、降低运动耐量并缩短生存期。目前的抗纤维化及PH靶向治疗对IPF-PH的疗效有限，而他克莫司（tacrolimus）在此复合疾病中的治疗作用仍未充分探索。 方法： 研究人员建立了博来霉素（bleomycin）诱导的IPF-PH大鼠模型。大鼠被随机分为对照组、博来霉素模型组、曲前列尼尔（treprostinil，阳性对照）组和他克莫司（0.05 mg/kg/天，皮下注射，21天）组。评估指标包括右心室收缩压（right ventricular systolic pressure，RVSP）、超声心动图、右心室及肺组织学、免疫组织化学、qRT-PCR和Western blot。体外实验中，用博来霉素联合或不联合他克莫司刺激C166内皮细胞和大鼠原代肺动脉内皮细胞（pulmonary arterial endothelial cells，PAECs）；用TGF-β1联合或不联合他克莫司刺激MOVAS平滑肌细胞。检测终点包括细胞活力、管形成、ROS、SOD/GSH、凋亡、增殖/迁移及MAPK/PI3K/AKT信号通路。 结果： 他克莫司降低了RVSP，改善了PAT/PET及右心功能，减轻了右心室肥厚和肺纤维化，并降低了血管壁厚度和α-SMA表达。他还下调了纤维化标志物Fn1和Col1a1。在内皮细胞中，他克莫司恢复了P-VEGFR2/VEGFR2和VE-cadherin的表达，促进了管形成，减少了凋亡（Bax/Bcl-2、cleaved caspase-9/3），并减轻了氧化应激（ROS、SOD/GSH、Keap1/HO-1）。在平滑肌细胞中，他克莫司抑制了TGF-β1诱导的增殖和迁移，并降低了Ki67表达。机制上，他克莫司在体内和体外均抑制了MAPK（JNK、ERK、p38）和PI3K/AKT通路的激活。 讨论： 他克莫司通过以血管重塑为导向的多靶点效应改善博来霉素诱导的IPF-PH，包括内皮保护、抑制氧化应激和凋亡，以及抑制平滑肌增殖，部分通过MAPK和PI3K/AKT信号通路介导。这些发现支持他克莫司作为IPF-PH潜在治疗候选药物，尤其适用于血管重塑突出的患者，同时强调在临床转化前需进一步开展剂量-反应、靶点特异性、免疫调节及给药优化研究。

一、研究背景与问题

特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种病因未明的慢性进行性间质性肺炎，临床以肺功能进行性下降和呼吸困难加重为特征。肺动脉高压（pulmonary hypertension，PH）是IPF最常见且最严重的并发症之一，二者合并即形成IPF-PH。PH的发生和进展不仅显著加重患者躯体损害、降低生活质量，还明显缩短生存期。据统计，约8%–15%的IPF患者在初次诊断时平均肺动脉压已达≥25 mmHg，晚期阶段该比例升至30%–50%，终末期则超过60%。IPF-PH的发病机制复杂，涉及肺间质纤维化、缺氧与低通气、炎症反应、血管内皮功能障碍、免疫交互作用、细胞因子异常表达及遗传因素等多重因素共同驱动。当前，IPF的一线抗纤维化药物如吡非尼酮、尼达尼布等虽可延缓肺功能下降，但对已形成的PH获益有限，甚至有研究提示尼达尼布可能与IPF-PH患者的PH进展相关。而PH靶向药物中，仅吸入型曲前列尼尔在初步临床研究中显示出延缓肺功能下降和改善运动耐量的潜力，其他如内皮素受体拮抗剂、可溶性鸟苷酸环化酶刺激剂等均在IPF-PH临床试验中因缺乏疗效或治疗组死亡率增加而失败。因此，临床上迫切需要能够同时作用于纤维化和肺动脉高压关键病理通路的药物。他克莫司（tacrolimus，TAC，又称FK506）是一种大环内酯类免疫抑制剂，既往研究提示其可分别缓解博来霉素诱导的肺纤维化和野百合碱诱导的肺动脉高压，但其在IPF-PH这一复合疾病中的作用尚缺乏系统研究。本研究旨在探索他克莫司在博来霉素诱导的IPF-PH模型中的治疗效果，并初步阐明其潜在作用机制。

二、研究内容与结论

研究人员建立了博来霉素诱导的IPF-PH大鼠模型，将大鼠随机分为对照组、模型组、曲前列尼尔阳性对照组和他克莫司治疗组，通过右心导管、超声心动图、组织学染色、免疫组化、qRT-PCR和Western blot等检测手段评估治疗效果。体外实验中，研究人员使用C166小鼠血管内皮细胞、大鼠原代肺动脉内皮细胞（pulmonary arterial endothelial cells，PAECs）和MOVAS小鼠血管平滑肌细胞，分别以博来霉素和TGF-β1刺激，考察他克莫司对内皮细胞活力、管形成、凋亡、氧化应激以及平滑肌细胞增殖和迁移的影响。研究结果表明，他克莫司能够显著降低模型大鼠的右心室收缩压（right ventricular systolic pressure，RVSP），改善右心功能，减轻右心室肥厚和肺纤维化程度，并改善肺血管重塑。机制上，他克莫司通过抑制MAPK（JNK、ERK、p38）和PI3K/AKT信号通路的激活，发挥内皮保护作用，减轻内皮细胞凋亡和氧化应激，恢复其血管生成能力，同时抑制平滑肌细胞的异常增殖和迁移。这些发现表明他克莫司可能通过以血管重塑为核心的多靶点机制改善IPF-PH，为其临床转化提供了实验依据。

三、主要关键技术方法

本研究采用的主要技术方法包括：博来霉素气管内滴注构建IPF-PH大鼠模型（SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验经南开大学动物护理和使用委员会批准，许可号2024-SYDWLL-000444）；右心导管术测量右心室收缩压；Vevo 2100高分辨率超声系统评估右心功能；苏木精-伊红（H&E）、Masson三色和天狼星红染色评估肺纤维化；免疫组织化学检测α-SMA评估血管重塑；Western blot检测信号通路蛋白表达；qRT-PCR检测基因表达；CCK-8法检测细胞活力；Matrigel管形成实验评估内皮细胞血管生成能力；Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡；DCFH-DA探针结合流式细胞术检测活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平；划痕愈合实验评估平滑肌细胞迁移能力。

四、研究结果

4.1 他克莫司改善博来霉素诱导的大鼠肺动脉高压和肺纤维化

通过右心导管测量发现，博来霉素诱导显著升高了大鼠RVSP，而他克莫司治疗组较模型组RVSP显著降低。超声心动图和心脏组织切片结果显示，他克莫司治疗显著改善了右心功能，并明显减少了右心室壁厚度。肺组织切片染色显示，博来霉素刺激显著增加了肺纤维化程度，而他克莫司有效减轻了博来霉素诱导的纤维化改变，Masson三色和天狼星红染色结果一致。此外，纤维化相关基因表达分析表明，他克莫司显著下调了纤维化标志物Fn1和Col1a1的表达。

4.2 他克莫司改善博来霉素诱导大鼠模型的血管重塑

肺组织H&E染色显示，博来霉素诱导的大鼠肺内微血管发生明显重塑，血管壁显著增厚。α-SMA免疫组织化学染色进一步证实了血管肌化程度的增强，而他克莫司治疗改善了血管壁厚度和肌化程度。肺组织中血管生成相关蛋白的表达分析支持上述发现。体外实验中，博来霉素显著抑制了C166细胞和原代PAECs的管形成能力，而他克莫司恢复了内皮细胞的血管生成能力。Western blot分析显示，博来霉素显著抑制了磷酸化VEGFR2（P-VEGFR2）和VE-cadherin的表达，而他克莫司逆转了这一抑制作用。

4.3 他克莫司减轻博来霉素诱导的内皮细胞凋亡

肺组织中凋亡相关蛋白和基因表达分析显示，博来霉素诱导后促凋亡蛋白Bax及其基因表达显著上调，抗凋亡蛋白Bcl-2及其基因表达显著降低，而他克莫司治疗逆转了这些变化。Annexin V-FITC/PI流式细胞术结果显示，博来霉素显著诱导了PAECs和C166细胞的凋亡，而他克莫司有效抑制了这一过程。Western blot分析表明，博来霉素刺激后cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和Bax蛋白水平升高，Bcl-2表达降低，他克莫司治疗后这些分子水平得到恢复。

4.4 他克莫司减轻内皮细胞氧化应激

肺组织中SOD和GSH水平检测显示，博来霉素诱导显著改变了二者的水平，而他克莫司减轻了这些变化。Keap1-HO-1通路分析显示，博来霉素上调了Keap1表达并下调了HO-1表达，表明肺组织存在氧化应激，他克莫司治疗逆转了这些变化。体外实验中，DCFH-DA探针检测显示博来霉素显著增加了PAECs和C166细胞中的ROS产生，而他克莫司有效减轻了氧化应激。SOD和GSH水平在他克莫司治疗后得到恢复，Keap1和HO-1相关基因和蛋白的表达也得到有效调节。

4.5 他克莫司在体内和体外均抑制MAPK和PI3K/AKT通路

Western blot结果显示，博来霉素显著激活了MAPK通路（JNK、ERK、p38）和PI3K/AKT通路（PI3K、AKT），而他克莫司干预后这些通路关键蛋白的磷酸化水平显著下调。体外内皮细胞实验中观察到了与体内一致的结果，表明他克莫司可能通过协同抑制MAPK和PI3K/AKT信号通路发挥治疗作用。

4.6 他克莫司在体外抑制血管平滑肌细胞增殖

CCK-8实验证实TGF-β1促进了MOVAS细胞增殖，而他克莫司显著抑制了这一效应。划痕愈合实验获得了一致的结果。增殖相关蛋白Ki67的检测显示，他克莫司也抑制了其表达，表明他克莫司有效抑制了体外平滑肌细胞的增殖。

五、讨论与结论

本研究表明，他克莫司在博来霉素诱导的IPF-PH大鼠模型中有效缓解了疾病进展，表现为RVSP降低、右心功能改善和肺纤维化减轻。这一治疗效应通过作用于血管系统和改善肺血管重塑实现。机制上，他克莫司对血管内皮细胞发挥直接保护作用，减轻其凋亡和氧化应激，恢复其体外血管生成能力，这些效应涉及MAPK和PI3K/AKT信号通路的调节。同时，他克莫司显著抑制了血管平滑肌细胞的增殖。与既往研究相比，本研究从血管视角探讨了他克莫司在IPF-PH中的作用，使用的剂量远低于IPF研究中常用剂量，提示低剂量他克莫司可能具有不单纯依赖免疫抑制的获益。与曲前列尼尔等现有PH治疗药物相比，他克莫司表现出直接抑制平滑肌增殖、减轻内皮损伤和促进血管正常化的潜力，可能在逆转肺血管重塑方面具有优势。研究也指出了若干局限性，包括未深入探讨免疫调节机制、未鉴定具体分子靶点、平滑肌细胞实验仅使用MOVAS细胞系、未在体外实验中纳入阳性对照、动物实验仅使用单一剂量等。综上，他克莫司通过内皮保护、调节MAPK和PI3K/AKT相关信号通路以及抑制平滑肌增殖来改善IPF-PH模型的肺血管重塑，这些特性使其成为区别于现有治疗方案的潜在治疗选择，尤其适用于血管重塑显著的IPF-PH患者。进一步的临床前安全性评估和前瞻性临床研究对于明确其疗效和安全性以及与现有抗纤维化或血管靶向药物联合治疗的潜力是必要的。