透明质酸-PEG改性的负载乐伐替尼的空心普鲁士蓝纳米粒子，用于肝细胞癌的化疗光热治疗

《Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology》：Hyaluronic acid-PEG-modified lenvatinib-loaded hollow Prussian blue nanoparticles for chemo-photothermal therapy of hepatocellular carcinoma

　　

摘要

乐伐替尼用于治疗晚期肝细胞癌（HCC），但其不良反应和药物耐药性可能会限制其临床疗效。我们开发了一种透明质酸-聚乙二醇改性的中空普鲁士蓝纳米颗粒（Len-HPBNs@HA-PEG），将药物递送与近红外光热治疗相结合。对这种制剂进行了物理化学表征，并在HepG2细胞以及携带皮下Hepa1–6肿瘤的小鼠中进行了评估。这些纳米颗粒的流体动力学直径约为160纳米，包封效率为57.64%，载药量为11.53%。在酸性条件下以及808纳米波长激光照射下，乐伐替尼的释放量会增加。光热效应随纳米颗粒浓度和激光设置的不同而增强，并且在三次加热-冷却循环中保持可重复性。与未经过透明质酸改性的制剂相比，经过改性的纳米颗粒与细胞的罗丹明B荧光反应更强。联合治疗组的平均凋亡率为73.06%，而单独使用乐伐替尼的凋亡率为46.65%，单独进行光热治疗的凋亡率为28.37%。在小鼠实验中，联合治疗组肿瘤体积最小，切除的肿瘤平均重量为0.09克，而对照组为0.88克。体重和血清生化指标表明，在所测试的给药方案下，这种纳米制剂具有良好的短期耐受性。总之，这些结果表明Len-HPBNs@HA-PEG可以作为肝细胞癌联合药物递送和光热治疗的临床前候选载体。

引言

2020年，全球新增肝癌病例约905,700例，死亡病例830,200例[1] [2]。慢性乙型肝炎仍是导致这一负担的重要原因[3]，肝细胞癌（HCC）是最主要的组织类型[4]。其他主要危险因素包括丙型肝炎、酒精相关性肝病和代谢功能障碍相关的脂肪性肝病[5] [6] [7] [8] [9]。遗传改变和代谢并发症也会影响疾病的发展和临床结果[10] [11]。治疗方案的选择取决于肿瘤负担、肝功能和患者的总体状况，这体现在巴塞罗那临床肝癌分期系统和临床指南中[12] [13]。系统治疗已经扩展到包括基于免疫的联合疗法，例如阿特珠单抗联合贝伐单抗[14]。然而，乐伐替尼联合帕博替尼的LEAP-002试验未能达到预定的总体生存期和无进展生存期的统计标准[15]。不良反应和药物耐药性继续限制着乐伐替尼的临床效果[16]，这促使人们寻求改进肿瘤暴露量的给药策略。

乐伐替尼（Len）可抑制血管内皮生长因子受体（VEGFR1–3）、成纤维细胞生长因子受体（FGFR1–4）、血小板衍生生长因子受体α、KIT和RET[17]。FGFR4信号通路与HCC的生长和对FGFR4靶向治疗的耐药性有关[18]。在REFLECT试验中，乐伐替尼在总体生存率方面不逊于索拉非尼；常见的不良反应包括高血压、腹泻、食欲减退和体重下降[19]。纳米载体可以改变药物的分布并协调其作用于靶点[20] [21] [22] [23]。它们的生物分布取决于被动积累以及表面配体与生物靶点之间的相互作用[24] [25] [26]。响应刺激的载体还可以将药物释放与局部条件或外部照射耦合[27]。这些特性为将乐伐替尼的递送与光热治疗结合提供了理论依据。

普鲁士蓝（PB）是一种铁氰铁酸盐配位聚合物。其不溶的口服制剂用于治疗放射性铯或放射性和非放射性铊的内部污染[28]。由于其在近红外范围内的吸收能力和可调节的表面化学性质，PB纳米颗粒作为光热剂受到了关注[29] [30] [31] [32]。中空PB纳米颗粒能够在保持光热加热所需光学特性的同时容纳药物[33]。808纳米波长的照射属于近红外光窗范围内，尽管组织衰减限制了其对深层病变的穿透力[33]。基于PB的材料还表现出催化和氧化还原活性[34] [35]。本文重点研究了其药物递送和光热功能。

透明质酸（HA）是一种生物相容性的多糖，常用于与表达CD44的细胞相互作用[36] [37]。这种相互作用已在巨噬细胞和癌症模型中得到研究[38] [39]。HA-zein纳米颗粒已被用于肝细胞癌中的紫檀酚递送[40]，基于HA的递送系统也已被开发用于乳腺癌[41]。因此，我们制备了装载乐伐替尼的透明质酸-聚乙二醇改性的中空普鲁士蓝纳米颗粒（Len-HPBNs@HA-PEG），并对其物理化学性质、药物释放和光热性能进行了研究，并在HepG2细胞及皮下Hepa1–6肿瘤模型中测试了其抗肿瘤效果。

章节片段

材料

乐伐替尼、透明质酸（HA）、甲基聚乙二醇氨基（mPEG-NH?）、1-乙基-(3-二甲氨基丙基)羰二亚胺（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、聚烯丙胺盐酸盐（PAH）、聚丙烯酸（PAA）、甲基聚乙二醇羧基（mPEG-COOH）和N,N-二甲formamide（DMF）均由北京英凯科技有限公司（中国北京）提供。K?Fe(CN)?、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和DiR荧光染料则购自上海阿拉丁生化科技有限公司。

HPBNs@HA-PEG的合成与表征

通过酸蚀立方体普鲁士蓝并对其进行表面改性制备了HPBNs@HA-PEG纳米颗粒。动态光散射显示其流体动力学尺寸分布呈单峰，中心波长约为160纳米（图1a）。图1b所示的三种制剂HPBNs、HPBNs@PEG和HPBNs@HA-PEG均具有负的Zeta电位，其中HPBNs@HA-PEG的Zeta电位最接近中性。SEM成像显示初始的普鲁士蓝纳米颗粒呈均匀的立方体形状（图1c）。

讨论

Len-HPBNs@HA-PEG结合了pH和近红外响应的药物释放机制，并实现了可重复的光热效应。在HepG2细胞中，联合治疗显著降低了细胞活力，平均凋亡率为73.06%，同时Bax表达增加而Bcl-2表达减少。在同一治疗方案下，皮下Hepa1–6模型中的肿瘤负荷最低。细胞和动物实验结果均支持该联合治疗在测试条件下的抗肿瘤效果。

PB骨架有助于药物的整合...

结论

Len-HPBNs@HA-PEG结合了乐伐替尼的递送和近红外响应的光热治疗。这种联合方案在HepG2细胞中引发了最强的凋亡反应，并在皮下Hepa1–6模型中降低了肿瘤负荷。短期体重和生化指标表明该纳米制剂具有良好的耐受性。这些结果为透明质酸改性的PB载体作为结合药物递送和局部光热治疗的临床前候选载体提供了支持。

伦理声明

动物实验得到了温州医科大学机构动物护理和使用委员会的批准（批准编号WYDW2022–0783），并遵循了该校的动物护理指南和伦理规定进行。

CRediT作者贡献声明

Wenke Yao：概念设计、数据整理、数据分析、方法学研究、资源获取、软件使用、结果验证、结果可视化、论文撰写及审稿编辑。Yu Wang：数据整理、资源获取、软件使用。Xueyi Song：数据整理、数据分析、方法学研究、资源获取、结果验证。Quan Zhou：数据整理、数据分析、方法学研究、软件使用、论文初稿撰写及审稿编辑。Yunshi Fan：数据整理、数据分析、方法学研究、资源获取、软件使用、结果可视化。

出版同意

不适用。

资助

本研究得到了以下项目的支持：浙江省医疗卫生科学技术项目（项目编号：2022RC302 和 2023RC312）、浙江省自然科学基金（项目编号：LLSSY24H160003）、丽水大学医学院联合创新与开放基金（项目编号：X111012）、河南省高等学校重点科研项目（项目编号：26B3500010）以及浙江省生物医学与药学重点学科项目。

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

无。

Wenke Yao|Yu Wang|Xueyi Song|Quan Zhou|Yunshi Fan|Abdullah Al Mamun|Md Siddiqul Islam|Lingna Li|Chuxiao Shao|Shuanghu Wang|Peiwu Geng

温州医科大学丽水医院中央实验室，丽水市人民医院，丽水市，浙江323000