《Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology》：Direct ultra-weak photon emission detection from mammalian cells using a photomultiplier tube-based system
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超弱光子发射（ultra-weak photon emission, UPE）指细胞在代谢活动过程中作为副产物自发产生的极低强度光发射。与依赖特定酶促途径的生物发光（bioluminescence）或由先前光暴露引发的非代谢物理过程——延迟发光（delayed
超弱光子发射（ultra-weak photon emission, UPE）指细胞在代谢活动过程中作为副产物自发产生的极低强度光发射。与依赖特定酶促途径的生物发光（bioluminescence）或由先前光暴露引发的非代谢物理过程——延迟发光（delayed luminescence, DL）不同，UPE被认为源于氧化代谢反应。尽管其在非化学信号传导等潜在生物学作用方面长期受到关注，但由于光子通量极低且常与DL混淆，哺乳动物系统中UPE的实验证据仍然有限。研究人员采用一套定制暗箱检测系统，配备灵敏的光电倍增管（photomultiplier tube, PMT），用于测量哺乳动物细胞培养物的UPE。研究结果证明，与培养基对照相比，MCF7细胞（12,588.36 ± 176.59 counts 对 12,121.51 ± 117.32 counts, p: 0.0012）、A549细胞（12,646.78 ± 232.85 counts 对 12,162.80 ± 89.43 counts, p: 0.0025）以及MCF10A细胞（12,158.84 ± 52.49 counts 对 12,004.37 ± 67.07 counts, p: 0.0037）均能实现可重复的UPE检测，且其发射可与DL明确区分。不同细胞系之间观察到独特的发射特征，癌来源细胞表现出高于非转化细胞的平均计数。此外，通过多柔比星（doxorubicin）介导的细胞凋亡诱导细胞应激，可显著增强MCF10A细胞的UPE强度，表明发射幅度与细胞应激之间存在关联。上述发现建立了一种稳健且可及的哺乳动物细胞系UPE检测方法，并为UPE强度反映代谢及应激相关过程提供了证据。该平台可面向健康和疾病状态下UPE动态的系统研究，并支持其作为细胞氧化状态无标记报告因子的潜在应用价值。
超弱光子发射（ultra-weak photon emission, UPE）是指活细胞和细胞器自发产生极低强度光发射的现象，其强度通常在紫外至近红外波段（约350–1270 nm）范围内约为1–1000 photons s?1 cm?2。UPE已被广泛认为是生命系统的一种普遍特征，既不同于酶介导的生物发光，也不同于延迟发光（delayed luminescence, DL）等非代谢的物理发光过程。尽管经历了数十年的研究，UPE的生物学作用仍存在争议，这在很大程度上归因于其检测困难。已提出的功能假说包括消散多余代谢能量以及介导细胞或亚细胞区室之间的非化学信号传导，暗示光子稳态的存在。
与荧光或磷光不同，UPE既非由外部激发驱动，也不依赖特殊的酶促途径。普遍认为UPE源于氧化代谢过程，尤其是涉及活性氧（reactive oxygen species, ROS）的过程。在细胞呼吸过程中，分子氧的部分还原生成超氧阴离子（O?•?），随后经超氧化物歧化酶转化为过氧化氢（H?O?），并进一步还原为高反应活性的羟基自由基（•OH）。这些ROS可氧化邻近的生物分子，产生不稳定中间体，进而弛豫至电子激发态。三重态羰基的衰变在紫外A波段至蓝绿波段（约350–500 nm）产生光子，而激发态色素向分子氧的能量转移产生单线态氧（1O?），其弛豫发射红光及近红外光子（约634–1270 nm）。在此框架下，UPE可视为涉及电子传递的氧化代谢的直接光学特征。值得注意的是，单线态氧和羟基物种的发射过于微弱，无法用现有光子检测方法探测。
在哺乳动物细胞中，线粒体承担了绝大部分胞内ROS的产生，估计高达90%，主要源于呼吸链复合物I和III的电子泄漏。因此，线粒体可能被视为UPE的主要胞内来源。重要的是，ROS水平及其相应的UPE强度是动态变化的，可随感染、机械损伤、电离辐射或药物干预等细胞应激源而显著升高，在此类条件下UPE强度可相对于基础水平上升数个数量级。
鉴于发射光的强度可反映系统的氧化状态，加之内源性生色团能够在紫外–可见光谱范围内吸收，长期以来存在一种假说认为UPE可能参与非化学生物信号传导。这一概念可追溯至二十世纪初Gurwitsch的“洋葱根”实验：邻近组织可改变细胞分裂速率，该效应可被不透明屏障消除，但可被透紫外石英保留。此后，大量研究报告了与UPE一致的非化学信号传导效应，涉及多种生物模型，包括离体线粒体、中性粒细胞和上皮细胞。综合评述已对这些观察进行了系统整理，并提出了超弱光介导生物相互作用的潜在机制。尽管文献众多，基于UPE的信号传导的存在性和功能相关性仍存在争议，一个核心批评在于其极低的光子通量难以产生可区别于周围环境和胞内噪声的信号。然而，尽管尚未通过实验观测证实，有学者提出细胞内的UPE强度高于细胞外部，提示UPE可能具有胞内信号传导作用，例如在视网膜拓扑视觉神经元的图像处理中起作用。
UPE的直接测量面临重大技术挑战。检测需要具备能够以极低噪声探测单光子事件且同时消除所有外部光源（包括可能超出目标信号数个数量级的实验室设备发射）的仪器。延迟发光（DL）进一步增加了问题复杂性：这是一种在先前的光暴露后持续存在的长时发光，可衰减数小时。尽管DL的强度可能达到甚至超过UPE，但它并非自发产生，也不直接来源于代谢过程。DL在生物和非生物材料中均可观察到，未能将其与UPE区分导致了文献中持续存在的误判。值得注意的是，虽然DL不同于UPE，其初始强度仍可能随生物学状态（如线粒体功能）而变化，进一步增加了诠释难度。可以认为DL在生物学过程中的作用尚未被完全理解。
因此，UPE的实验方法须满足三个标准：(i) 光子探测器须对超低计数率具有足够灵敏度；(ii) 须严格消除所有背景光和杂散光；(iii) 须明确考虑并排除延迟发光。研究人员此前已开发了此类绝对暗检测系统，将PMT置于多层遮光外壳内，并证明其能够从萌发的绿豆中检测到UPE（与DL分离），其中发射强度随生长、脱水和激素处理而可预期地变化。在该验证方法的基础上，本研究旨在建立一个可靠且可重复的哺乳动物体外UPE检测模型。研究人员使用相同的仪器，研究了三种商业化细胞系MCF7、A549和MCF10A的UPE发射，这些细胞系被选作不同代谢速率和癌变状态的代表，并检测了在诱导细胞应激条件下发射强度的变化。通过在定义明确的细胞培养系统中直接表征UPE，本研究旨在弥补一个关键的方法学空白，为生物超弱光子发射的机制和功能研究奠定基础。研究人员利用三种ATCC来源的哺乳动物细胞系（MCF7人乳腺癌上皮细胞、A549人肺癌上皮样细胞和MCF10A正常人乳腺上皮细胞），采用自主搭建的PMT单探测器和双探测器暗箱系统，在严格避光、排除延迟发光的条件下，对细胞培养物及其相应培养基进行了长达72小时的UPE连续记录；通过面积曲线积分进行统计学比较，结合活细胞计数和归一化分析，并采用多柔比星诱导细胞凋亡模型验证UPE强度与氧化应激的关系。
结果部分：
3.1 区分UPE与延迟发光：通过对比经15分钟环境光暴露与全程避光的MCF7细胞、完全培养基和无细胞空皿的发射曲线，发现光暴露样品均表现出以初始高速率发射、约2小时内衰减的DL特征，其平均总计数在空皿（20.28 ± 5.24 counts 对 8.62 ± 8.62 counts, p: 0.002）、培养基（35.75 ± 6.35 counts 对 12.93 ± 1.93 counts, p: 0.004）和细胞（21.39 ± 0.56 counts 对 14.39 ± 1.93 counts, p: 0.004）中均显著高于避光样品，证实DL可超过基础UPE并混淆生物学信号解读，严格避光是UPE检测的先决条件。
3.2 哺乳动物细胞培养物的UPE检测：在72小时记录中，MCF7、A549和MCF10A三种细胞系的平均总计数均显著高于对应培养基对照，MCF7为12,588.36 ± 176.59 counts 对 12,121.51 ± 117.32 counts (p: 0.00116)，A549为12,646.78 ± 232.85 counts 对 12,162.80 ± 89.43 counts (p: 0.00248)，MCF10A为12,158.84 ± 52.49 counts 对 12,004.37 ± 67.07 counts (p: 0.0037)。在时间动态上，MCF7和A549发射速率随时间增加而MCF10A逐渐下降。经培养基本底校正后，MCF7（466.85 ± 176.59 counts）和A549（483.98 ± 232.85 counts）的平均计数均显著高于MCF10A（154.46 ± 52.49 counts），MCF7与A549之间无显著差异，表明癌来源细胞的整体UPE强度高于非转化细胞。
3.3 细胞计数：在72小时非生理条件暴露期间，A549活细胞数从24小时的7.09 ± 1.09 × 10?降至72小时的2.76 ± 1.38 × 10? (p = 0.03)，MCF7从4.54 ± 0.43 × 10?降至1.99 ± 0.72 × 10? (p = 0.00172)，而MCF10A活细胞数无显著变化，说明非生理培养条件对癌细胞系产生了明显的生存压力。
3.4 将UPE归一化至细胞数量：在24小时和48小时时间点，MCF10A的单细胞光子计数（4.71 ± 0.03 × 10??和4.56 ± 0.03 × 10?? counts per cell, cpc）均显著高于MCF7（3.89 ± 0.03 × 10??和4.29 ± 0.07 × 10?? cpc）和A549（2.88 ± 0.03 × 10??和3.21 ± 0.07 × 10?? cpc）。至72小时，MCF7的单细胞计数（8.92 ± 0.26 × 10?? cpc）显著超过A549（6.13 ± 0.23 × 10?? cpc）和MCF10A（5.55 ± 0.02 × 10?? cpc）。表明UPE反映的是细胞代谢和应激状态而非单纯的生物量。
3.5 凋亡诱导对MCF10A UPE强度的影响：以12.5 μM多柔比星处理MCF10A细胞24小时后继续检测48小时，多柔比星处理组的平均每秒计数高于溶剂对照（DMSO），其平均总计数（374.20 ± 36.72 counts）显著高于对照组（120.40 ± 52.63 counts, p: < 0.001），证实药理学诱导的氧化应激可使UPE强度增加逾三倍。
讨论部分表明，本研究通过严格排除DL，直接且可重复地证明了贴壁哺乳动物细胞能够发射可测量的超弱光子，且发射强度因细胞类型和代谢状态而异。多柔比星诱导的ROS升高与UPE增强的对应关系支持UPE作为氧化还原生物学光学相关物的诠释。尽管受限于PMT光谱整合范围（300–600 nm）尚无法区分三重态羰基与单线态氧途径，且离体线粒体的DL排除与呼吸功能维持存在时间不相容的技术挑战，该方法框架仍为系统探索健康和疾病状态下的UPE动态及细胞氧化状态的无标记监测提供了可重复的平台。
