整合批量与单细胞转录组分析提示 THBS1 在脓毒症中具有髓系相关免疫的候选作用

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Integrated bulk and single-cell transcriptomic analyses suggest a myeloid-associated candidate role of THBS1 in sepsis

背景：脓毒症（sepsis）仍是全球主要死亡原因，整合炎症失调、免疫细胞定位和预后相关性的生物标志物仍有限。为识别与脓毒症中髓系免疫反应相关的候选分子，研究人员对公共批量转录组数据集、单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据、一个小型探索性临床RNA测序（RNA-seq）队列及化合物筛选分析进行了整合分析。
结果：公共数据集中的差异表达分析和荟萃分析（meta-analysis）鉴定 THBS1 为脓毒症中持续改变的转录本。在一个包含23例脓毒症患者和10例健康对照的小型探索性外周血转录组队列中，基于 THBS1 在公共数据蛋白质–蛋白质相互作用（PPI）网络中的位置及后续以 THBS1 为重点的分析，THBS1 被选入下游分析。复用的临床RNA测序（RNA-seq）队列仅作为探索性描述保留，未用于声称独立验证。单细胞分析提示 THBS1 表达在部分髓系相关细胞群亚群中更突出。外部数据集中的生存分析表明，高 THBS1 表达与较差结局相关，但该发现应作为探索性结果解释，因为无法对疾病严重程度进行正式校正。通过数据库挖掘和分子对接进一步优先筛选与 THBS1 相关的候选化合物。
结论：本研究提供转录组和计算证据，提示 THBS1 可能与脓毒症中的髓系相关免疫活性和不良预后相关。由于临床队列较小，未进行蛋白水平验证和功能实验，且公共数据集间观察到显著异质性，这些发现应解释为初步的和产生假设的。

研究背景与问题：脓毒症（sepsis）是由宿主对感染反应失调所致危及生命的综合征，表现为系统性炎症、免疫功能障碍和多器官衰竭；其病理涉及炎症细胞活化、免疫麻痹、代谢失调、内皮损伤、凝血障碍和调节性细胞死亡。全球疾病负担显著且存在地区和社会经济差异。现有生物标志物研究已从传统炎症指标转向宿主反应特征和免疫调节分子，但能连接炎症失调、免疫细胞定位、预后及潜在治疗相关性的可解释靶点仍有限。差异表达基因（DEGs）可能有助于脓毒症早期识别和预后分层，计算化合物筛选可提供初步分子线索。作者团队既往以 CD27、KLRB1、RETN 和 CD163 为中心，利用 GSE134347、GSE167363、GSE220189 和机构RNA测序队列 CNP0002611 研究脓毒症生物标志物组合（Li et al.）。本研究复用这些数据集和若干上游分析步骤，聚焦更窄的 THBS1 问题，并增加 THBS1 特异性探索性生存评估、跨队列 THBS1 表达综合、基于 HERB 2.0 的化合物优先级筛选和分子对接；这些新增不构成对复用队列的独立验证或治疗效果证明。研究人员整合公共批量微阵列、单细胞RNA测序（scRNA-seq）和既往报道的探索性外周血RNA测序（RNA-seq）队列，采用差异表达、富集和蛋白质–蛋白质相互作用（PPI）分析优先筛选 THBS1，并检查跨队列转录本关联、公共数据集生存和免疫细胞群分布，最后用 HERB 2.0 优先候选化合物进行探索性分子对接。结论提示 THBS1 可能与脓毒症髓系相关免疫活性和不良预后相关；由于临床队列小、未做蛋白验证和功能实验、公共数据集异质性大，结果应视为初步和产生假设。

关键技术方法：研究整合公共GEO数据集 GSE134347（批量微阵列）、GSE167363与GSE220189（scRNA-seq）、GSE65682（生存）及10个GEO数据集（荟萃分析）；临床样本来自西南医科大学附属医院急诊ICU的CNP0002611队列，含23例脓毒症和10例健康对照，外周血RNA-seq。技术包括差异表达分析（iDEP 0.96、Xiantao平台；|log₂FC|≥1、FDR<0.05）、基因本体（GO）/京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集、STRING PPI、Cell Ranger/Seurat/Harmony/SingleR单细胞分析、Kaplan-Meier与log-rank生存分析、随机效应标准化均数差（SMD）荟萃分析及leave-one-out、HERB 2.0化合物筛选和AutoDock Vina分子对接。

研究结果：
1. 脓毒症中差异表达mRNA的鉴定：GSE134347随机选取50例脓毒症和50例健康对照，质控后PCA显示组间转录组差异；鉴定718个DEGs（299个上调、419个下调）。GSE167363和GSE220189整合scRNA-seq鉴定243个DEGs（153个上调、90个下调）。结论为脓毒症在批量转录组和单细胞水平均存在显著转录组改变。
2. 炎症和免疫相关通路的功能富集：GSE134347的DEGs在GO中主要富集于免疫相关细胞组分和分子功能，KEGG富集于炎症和免疫相关通路；scRNA-seq的DEGs在GO中主要涉及抗病毒反应、免疫反应和免疫系统过程，KEGG富集于免疫相关通路。
3. PPI网络分析识别THBS1为枢纽靶点：Venn分析识别57个重叠DEGs；PPI网络显示两个主要枢纽模块，一个以CD3D、CD2、GZMK、CCL5为中心，另一个以THBS1、MMP9、PPBP为中心。基于THBS1高网络连接度、公共数据集差异表达和潜在预后相关性，将其选为关键候选靶点；临床RNA-seq仅在复用探索队列中作描述性检查。
4. 探索性队列的临床特征：23例脓毒症和10例健康对照中，THBS1表达均值分别为12.510和10.881，描述性log₂算术均值比为+0.201，SMD（Hedges’ g）为+0.171；双侧精确Mann–Whitney检验未检测组间差异（P=0.893）。因队列小且分布变异，结果不支持临床验证。
5. THBS1在脓毒症中的预后相关性：GSE65682按中位表达分高低组；CD3D和CD2高表达与更好生存相关；THBS1高表达与更差生存相关（log-rank P=0.0029），PPBP不显著（P=0.36）。高THBS1与较短生存相关，但因无法正式校正疾病严重程度，应作探索性解释。
6. 公共数据集中THBS1表达的荟萃分析：10个GEO数据集含867例脓毒症和307例健康对照；随机效应合并SMD为?0.7847（95% CI ?1.2030至?0.3664），I²=86%，τ²=0.3694，P<0.01；负SMD表示脓毒症中THBS1转录本较高（健康对照减脓毒症）。leave-one-out后合并SMD仍为负且显著，范围?0.897至?0.674，I²为74.1%–84.3%。平台分层中，5个微阵列SMD为?1.0804（95% CI ?1.5780至?0.5829；I²=82.33%），5个RNA-seq SMD为?0.4475（95% CI ?0.8149至?0.0801；I²=50.76%）；名义平台间P=0.0449，但排除发现数据集后不稳健（P=0.1888）。结论为探索性跨队列证据，并非统一精确效应或诊断性能。
7. THBS1在免疫细胞亚群的单细胞定位：12个样本经质控和DoubletFinder后保留60,480个细胞，注释为T细胞、单核细胞、B细胞、自然杀伤（NK）细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞和祖细胞相关群。THBS1在多个脓毒症相关免疫细胞群可检测，视觉上在部分髓系相关细胞群更丰富，在B细胞、NK细胞和中性粒细胞较低；仅作描述性分析，未进行正式统计检验。
8. THBS1相关候选化合物的筛选：HERB 2.0显示不同处理后THBS1表达有降有升；这些关联不建立直接靶点结合或脓毒症抗炎活性。
9. 候选化合物与THBS1的分子对接：脱氧胆酸（PubChem CID 222528）和resveratrol（PubChem CID 445154）对接人THBS1 N端结构（PDB ID: 2ERF），预测结合能分别为?6.6和?6.4 kcal/mol；这些为计算估计，无实验结合对照或功能实验，不能建立直接结合或治疗活性。

讨论总结：讨论指出，整合公共批量转录组、scRNA-seq和临床外周血RNA-seq后，THBS1作为与炎症失调和不良预后相关的候选枢纽靶点，其证据层包括差异表达、PPI、复用小型探索队列描述性评估、生存、跨队列荟萃分析、单细胞定位、化合物数据库筛选和分子对接；因研究主要基于计算和转录组，结果应视为初步和产生假设。与Li et al.既往研究直接比较，两文使用相同GSE134347、GSE167363、GSE220189和CNP0002611，50对50发现策略及若干上游差异表达、富集和网络分析重叠；既往研究识别CD27、KLRB1、RETN、CD163并强调机器学习诊断性能，本文为以THBS1为中心的重分析，增加GSE65682生存、多队列综合、化合物筛选和对接，并非独立复制。THBS1可能影响内皮细胞行为、单核/巨噬细胞谱系活化、T细胞反应和炎症信号，并可通过特定结构基序激活潜伏TGF-β，提供潜在机制联系，但未实验检查上游调节或下游通路，机制解释仍属假设。预后分析中高THBS1与较差生存相关，但疾病对照差异表达与疾病内预后分层属不同分析层次，且SOFA/APACHE II不可用或不完整，不能多变量校正，残余混杂不能排除。单细胞定位提示THBS1视觉上在部分髓系相关群更丰富，但为描述性和可视化，未正式统计比较细胞类型或疾病状态，需巨噬细胞模型、THBS1敲低/过表达、受体阻断和动物模型验证。HERB 2.0和对接优先脱氧胆酸和resveratrol为探索性THBS1相关候选；resveratrol有抗炎和代谢作用报道，脱氧胆酸为参与代谢和炎症调节的次级胆汁酸，但这些不表明二者通过THBS1在脓毒症中作用；对接缺实验阳性和阴性对照，有利预测结合能不能建立物理结合或细胞活性。荟萃分析提供跨队列探索证据，SMD以标准差单位计，不应等同于百分比变化、诊断准确性或生物功能；平台分层均负但微阵列异质性大且平台间比较敏感；不能估计感染来源特异合并效应；leave-one-out未显示方向由单一数据集驱动，但异质性持续，可能来自人群、疾病严重程度、感染来源、样本类型、平台和分析流程差异；合并SMD非精确通用效应。局限性包括临床队列小、单中心、无前瞻样本量计算，仅作探索；缺蛋白验证；脓毒症休克、感染来源和存活/非存活亚组不能可靠分析；传统生物标志物降钙素原、C反应蛋白、乳酸和IL-6不均一，THBS1增量价值未知；单细胞因果未测；化合物和对接为计算假设；血小板混杂可能影响THBS1解释；在线平台分析需脚本化版本控制流程。

研究结论翻译：综上所述，这项整合转录组和计算研究提示 THBS1 可能与脓毒症中的髓系相关免疫活性和不良预后相关。THBS1 得到差异表达分析、临床转录组评估、生存分析、跨队列荟萃分析、单细胞定位和计算化合物优先级筛选的支持。然而，由于临床队列小且为探索性，未进行蛋白水平验证和功能实验，并观察到显著的跨数据集异质性，这些发现应视为初步和产生假设的。在 THBS1 可被视为脓毒症临床适用生物标志物或治疗靶点之前，需要在大规模前瞻性队列、蛋白水平检测、细胞实验、动物模型和临床前研究中进一步验证。