《Frontiers in Microbiology》：Gut microbiota developmental trajectories in min and DLY pigs during lactation and nursery stages and the alleviation of ETEC-induced diarrhea by fecal microbiota transplantation
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摘要
引言：肠道菌群在猪的生长、肠道屏障功能及抗病能力中发挥重要作用，然而宿主遗传对菌群发育的影响及品种特异性表型背后的机制尚不清楚。本研究调查了遗传背景不同的猪品种的肠道菌群动态变化，并评估了品种特异性菌群对肠道健康的功能影响。
方法：研究人员选取来自民猪和
摘要
引言：肠道菌群在猪的生长、肠道屏障功能及抗病能力中发挥重要作用，然而宿主遗传对菌群发育的影响及品种特异性表型背后的机制尚不清楚。本研究调查了遗传背景不同的猪品种的肠道菌群动态变化，并评估了品种特异性菌群对肠道健康的功能影响。
方法：研究人员选取来自民猪和杜洛克×长白×大白（DLY）猪的76头健康3日龄仔猪，从第3天至第49天进行监测。利用高分辨率2bRAD-M测序技术，在八个发育阶段分析菌群组成。在第49天采集肠道组织，用于空间菌群谱分析和屏障功能评估。此外，将12头21日龄DLY仔猪分为对照组、产肠毒素大肠杆菌（ETEC）K88攻毒组和粪菌移植（FMT）组，以评估民猪菌群的保护作用。
结果：在微生物组成、发育轨迹和生态演替模式方面观察到显著的品种特异性差异。与DLY猪相比，民猪在早期断奶阶段表现出更高的微生物多样性和更强的群落稳定性，同时伴随改善的肠道屏障完整性和降低的腹泻发生率。来自民猪的FMT显著增强了微生物多样性，强化了肠道屏障功能，并在ETEC攻毒后减轻了腹泻。
讨论：这些发现表明，宿主遗传塑造了肠道菌群的发育，进而影响肠道健康和疾病抵抗力。源自民猪的菌群对肠道感染具有保护作用，凸显其作为改善商业化猪生产肠道健康的微生物资源的潜力。
论文解读
一、研究背景与科学问题
肠道菌群在宿主免疫防御中发挥重要作用，菌群失调与炎症性肠病、心血管疾病、过敏、糖尿病和肥胖等多种疾病密切相关。猪的肠道菌群发育受年龄、环境、应激、日粮、健康状况及抗生素使用等多重因素影响，其中出生和断奶是菌群发育的关键生命阶段。在常规养猪生产中，仔猪于3至4周龄断奶，从富含脂肪和乳糖的母乳过渡到含复杂碳水化合物的固体饲料。断奶期是生猪生产的关键时期，直接影响养殖经济效益。然而，这一转变伴随营养、生理和心理上的突然应激，导致断奶应激，改变小肠形态和功能，损害消化吸收能力，破坏肠道屏障，并引发菌群失调，进而造成采食量下降、腹泻发生率升高和生长迟缓。
产肠毒素大肠杆菌（ETEC）感染是猪断奶后腹泻的主要原因，在全球养猪业造成重大经济损失。ETEC黏附于小肠并定植感染，肠毒素分泌破坏肠道屏障并诱发断奶仔猪炎症反应。粪菌移植（FMT）旨在快速重建肠道菌群的正常功能和组成，辅助治疗肠道及肠道外疾病，并可作为抵御ETEC定植和感染的策略。
越来越多的证据表明，本土民猪与商业化杜洛克×长白×大白（DLY）猪的肠道菌群组成存在显著差异，这可能影响其健康和抗病能力。然而，菌群在肠道各段中的定植、发育和成熟动态仍缺乏系统表征。此外，这些微生物差异是否有助于增强肠道屏障功能和病原体抵抗力，尤其是对ETEC K88的抵抗力，尚需进一步研究。2bRAD-M是一种利用IIB型限制性内切酶的简化基因组甲基化测序方法，可同时检测肠道菌群组成和DNA甲基化模式，适用于微生物表观遗传学研究。
二、研究设计与主要技术方法
本研究共纳入76头健康3日龄仔猪，平均体重1.2±0.75 kg，来自民猪和DLY两个品种，来源于哈尔滨古氏农牧集团和兰西繁育场（中国黑龙江兰西）。实验分为三部分：品种比较实验、肠道黏膜屏障功能分析和FMT与ETEC感染实验。FMT实验中，12头21日龄DLY仔猪随机分为对照组、ETEC感染组和FMT处理组（每组4头），FMT组连续5天每日口服民猪粪菌悬液（2 mL/头/天），第42天起ETEC感染组和FMT组连续5天口服ETEC K88菌株（6×109 CFU/mL，20 mL/头/天）。
关键技术方法包括：2bRAD-M测序技术分析肠道菌群组成，利用GTDB和Ensembl数据库中404,199个微生物基因组构建2bRAD标记数据库；实时荧光定量PCR检测基因表达和ETEC K88载量；Western blotting检测紧密连接蛋白表达；苏木精-伊红（H&E）染色和阿尔辛蓝-过碘酸雪夫（AB-PAS）染色观察肠道形态；扫描电子显微镜（SEM）观察肠道超微结构；酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清炎症细胞因子和免疫球蛋白水平。
三、研究结果
3.1 DLY猪哺乳期和保育期肠道菌群的动态演替
DLY猪肠道菌群α多样性（chao1和Shannon指数）随年龄增长逐渐增加，但在第35天（对应断奶）出现急剧下降，第42天恢复。断奶后，尽管引入固体饲料，α多样性保持相对稳定。主坐标分析（PCoA）显示哺乳期和断奶后猪的菌群组成存在显著差异。在门水平，拟杆菌门（Bacteroidota）和芽孢杆菌门（Bacillota）是优势菌门，占总序列的70%以上。普雷沃氏菌属（Prevotella）是最丰富的菌属，断奶后尤其增加，而拟杆菌属（Bacteroides）丰度随年龄逐渐下降。第49天各肠段分析显示，大肠（盲肠、结肠）的微生物多样性和相对丰度高于小肠（十二指肠、空肠、回肠），小肠和大肠样本在PCoA分析中明显分离。
3.2 民猪哺乳期和保育期肠道菌群的动态演替
民猪肠道菌群多样性和丰度在断奶后增加，但增速慢于断奶前。PCoA分析显示哺乳期和断奶后猪的菌群谱明显分离。在门水平，拟杆菌门（Bacteroidota）、假单胞菌门（Pseudomonadota）、芽孢杆菌门（Bacillota）和梭杆菌门（Fusobacteriota）为优势菌门，其中拟杆菌门最丰富，与芽孢杆菌门合计约占总序列的70%。普雷沃氏菌属（Prevotella）是研究期间最多样化和优势的菌属，尤其在引入固体饲料后。值得注意的是，隐杆线菌属（Cryptobacteroides）在民猪断奶后两个时间点成为优势菌属。第49天各肠段分析显示，盲肠和结肠的α多样性高于回肠，小肠和大肠的菌群组成存在明显分离。
3.3 猪品种决定肠道菌群组成和多样性的分化发育
不同猪品种的肠道菌群组成和肠道性状存在显著差异。断奶后民猪肠道菌群多样性和丰度再次增加，但增速慢于断奶前，而DLY猪的微生物群落在28日龄后保持相对稳定。两个品种的微生物丰富度均先下降后上升。哺乳期DLY仔猪至第28天保持高微生物丰富度，断奶后第35天α多样性显著降低。民猪中益生菌物种如拟杆菌属（Bacteroides）和普雷沃氏菌属（Prevotella）的丰度高于DLY猪。第49天分析显示，大肠的微生物多样性和丰富度高于小肠。β多样性分析显示民猪和DLY猪的菌群明显聚类分离，非度量多维标度（NMDS）分析显示两个品种在每个肠段内均存在显著的组成差异。在真菌群落方面，DLY猪出生后检测到子囊菌门（Ascomycota）、微孢子虫门（Microsporidia）和隐真菌门（Cryptomycota），断奶前检测到肠微孢子虫科（Enterocytozoonidae）、酵母菌科（Saccharomycetaceae）等，断奶后肉座菌科（Hypocreaceae）成为优势真菌。民猪中副孢霉属（Parasitella）和Paramicrosporidium saccamoebae是最普遍的真菌物种，出生时未检测到可检测的真菌群落。
3.4 DLY猪和民猪肠道菌群组成呈现品种特异性差异
第49天，两个品种不同肠段的菌群组成差异显著。在门水平，小肠以芽孢杆菌门（Bacillota）和假单胞菌门（Pseudomonadota）为主，大肠主要由拟杆菌门（Bacteroidota）和芽孢杆菌门（Bacillota）组成，这种肠段特异性模式在两个品种中保守。尽管空间模式相似，但存在显著的品种特异性差异：DLY猪小肠中Bacillota A约占细菌群落的50%，而民猪仅占20%。在属水平共注释到1,640个属，普雷沃氏菌属（Prevotella）主要在盲肠和结肠富集，埃希氏菌属（Escherichia）和乳杆菌属（Lactobacillus）在民猪中显著高于DLY猪。相反，艰难梭菌属（Clostridioides）在DLY猪中占优势，约占总细菌丰度的41%，显著高于民猪。在物种水平，Prevotella sp000434975在DLY猪中更丰富，而Phocaeicola vulgatus和脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）在民猪中优先富集。大肠杆菌（Escherichia coli）在DLY猪新生期和断奶期的丰度均显著更高。真菌群落也呈现品种特异性，民猪的真菌多样性高于DLY猪，白色念珠菌（Candida albicans）是两个品种大肠中的优势真菌物种。
3.5 民猪肠道菌群表现出优于DLY猪的代谢能力
基于PICRUSt的京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析显示，民猪在全局概览图、碳水化合物代谢、代谢功能、次级代谢物生物合成等方面表现出比DLY猪更强的能力。直系同源蛋白簇（COG）通路富集分析显示，两个品种的肠道菌群功能随年龄增长而变化。民猪中代谢、遗传信息处理、环境信息处理、细胞处理和生物体系统等关键功能通路在出生后至第14天保持活跃，而DLY猪在出生后第一周菌群功能即出现下降。第49天各肠段功能比较显示，与盲肠和结肠相比，小肠肠道细菌在代谢、遗传信息处理、环境信息处理、细胞处理和生物体系统方面表现出更高的活性。
3.6 民猪在肠道韧性和抗炎方面优于DLY猪
民猪生长速度慢于DLY猪，但在49天观察期内保持稳定的体重增长。断奶后DLY猪的腹泻率高于民猪，民猪的平均腹泻率约低25%。组织学检查显示，民猪的十二指肠、空肠和回肠保持相对完整和排列良好的绒毛结构，而DLY猪表现出更不规则的绒毛形态和偶尔的上皮脱落。超微结构检查进一步揭示了两个品种顶端刷状缘组织的差异。民猪的绒毛高度和隐窝深度大于DLY猪。在炎症反应方面，DLY猪的炎症细胞因子水平显著高于民猪，尤其在回肠。民猪在所有肠段的紧密连接蛋白水平显著更高，表明肠道屏障完整性更好。Toll样受体（TLR）信号通路分析显示，DLY组在十二指肠的TLR4和NF-κB表达显著高于民猪组，空肠的TLR4表达显著升高，回肠的TLR4、MyD88和NF-κB表达均显著高于民猪组。
3.7 FMT重塑DLY猪肠道菌群向更健康的方向发展
α多样性分析显示，FMT组在第28天和第42天的微生物丰富度和多样性均高于对照组，表明FMT改善了DLY猪的微生物多样性。NMDS分析和非加权组平均法（UPGMA）聚类显示FMT组和对照组样本形成明显分离的聚类，表明FMT显著改变了肠道菌群结构。在门水平，拟杆菌门（Bacteroidota）、芽孢杆菌门（Bacillota）和螺旋体门（Spirochaetota）是两个组的主要菌门。FMT导致第28天和第42天拟杆菌门相对丰度升高、芽孢杆菌门丰度降低。在属水平，FMT组Faecousia丰度增加，第28天Vescimonas和隐杆线菌属（Cryptobacteroides）增加，而艰难梭菌属（Clostridioides）相对丰度显著降低。
3.8 FMT通过屏障-免疫串扰修复ETEC诱导的肠道损伤
与ETEC组相比，FMT组猪的体重随时间显著改善，缓解了ETEC K88感染引起的生长迟缓。FMT组的腹泻发生率显著低于ETEC组，表明FMT有效减轻了ETEC诱导的腹泻并促进受体猪的体重增长。粪菌预处理显著降低了肠道中ETEC K88的定植量。FMT组血清ETEC特异性IgG和空肠、回肠黏膜分泌型IgA（SIgA）水平显著高于ETEC组。组织学检查显示ETEC组十二指肠、空肠和回肠绒毛损伤显著，而FMT组肠道形态明显保留，绒毛损伤显著减少。FMT在mRNA和蛋白水平恢复了紧密连接蛋白Occludin和Claudin-1的表达。FMT组血清和结肠组织中炎症细胞因子IL-10、IL-6和TNF-α的表达水平较ETEC组显著降低。ETEC K88感染升高了断奶猪回肠中TLR4、MyD88和NF-κB的mRNA水平，而FMT组这些水平显著降低。
四、讨论与结论
本研究揭示了猪肠道菌群发育受年龄、肠段和宿主品种的强烈影响。断奶是菌群发育的关键转折点，表现为微生物多样性的暂时性降低和群落结构的显著重组，小肠和大肠之间维持着不同的微生物谱。品种比较分析显示民猪和DLY猪在微生物演替方面存在显著差异。民猪肠道中益生菌物种如解淀粉乳杆菌（Lactobacillus amylovorus）和约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）的相对丰度高于DLY猪，这些物种与增强对应激和炎症的抵抗力有关。民猪中Phocaeicola vulgatus和脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）的富集与其抗炎和免疫调节功能相关。
ETEC K88感染通过MyD88依赖性TLR4/MyD88/NF-κB信号通路影响免疫应答。FMT显著下调感染猪空肠和回肠中TLR4、MyD88和NF-κB的mRNA表达，伴随TNF-α和IL-6水平降低，表明FMT通过调节MyD88依赖性通路帮助恢复免疫稳态，增强宿主对ETEC K88的先天免疫防御。接受健康民猪粪菌移植的DLY猪表现出与本土民猪相当的疾病抵抗力。
结论：本研究证明猪肠道菌群发育受年龄、肠段和宿主品种的强烈塑造。与DLY猪相比，民猪表现出更高的细菌和真菌多样性、益生菌相关类群的更大富集以及增强的预测代谢能力，尤其在早期生命和断奶后阶段。此外，民猪通过增强黏膜防御表现出更强的肠道屏障功能。FMT改善了商业化DLY猪的微生物多样性及其对ETEC K88的抵抗力。
