利用实时核磁共振波谱定量分析APOBEC3C的位置依赖性脱氨作用

《Journal of Magnetic Resonance》：Quantifying position-dependent deamination by APOBEC3C using real-time NMR spectroscopy

　　

• •
  在UDG测定中，A3C对3′端近位dC靶位产生更高的产物比例。
• •
  A3C偏好3′端近位靶位，而A3G偏好5′端近位靶位。
• •
  实时NMR显示A3C在C22位的表观速率比C6位高2.2倍。
• •
  Loop 7的差异可能是A3C和A3G具有相反位置偏好性的原因之一。

引言

人源载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3（APOBEC3；A3）家族包含七种成员，它们催化单链DNA（ssDNA）中脱氧胞苷（dC）脱氨基生成脱氧尿苷（dU）。这些酶通过限制逆转录病毒（包括人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1））的复制以及逆转录转座子的动员，在先天免疫中发挥重要作用[1]、[2]、[3]、[4]。

尽管A3蛋白包含一个或两个保守的锌依赖性胞苷脱氨酶结构域，但不同A3蛋白在催化活性、序列偏好性、连续性和致突变性方面存在显著差异[5]。关于ssDNA识别和连续性脱氨基的分子基础，对APOBEC3G（A3G）的研究最为广泛[6]、[7]、[8]。

A3G优先脱氨5′-CCC基序中的dC残基。它还能在单次酶-底物结合中脱氨多个靶标dC残基。这种连续性行为被认为是通过短程滑动和长程移位实现的促进扩散[6]、[7]。在我们先前的实时核磁共振（NMR）研究中，在同一ssDNA中，A3G对5′端近位靶标dC的脱氨效率高于对3′端近位dC靶标[6]。时间进程数据可由以下模型定量解释：A3G沿ssDNA双向滑动，且当A3G沿3′到5′方向接近靶标dC时，脱氨效率高于沿5′到3′方向接近时。

先前的研究使用含有两个靶标dC残基且间隔分别为5或63 nt的ssDNA底物，在人APOBEC3C（A3C）常见S188形式下单次撞击条件下研究了其连续性。对于间隔为5 nt的底物，双脱氨基产物低于该测定的检测限，因此无法计算连续性因子。相比之下，间隔为63 nt的底物产生了一个低但可测量的连续性因子1.3，表明在单次酶-底物结合中存在微弱的长程连续性[9]。因此，检测到了微弱的长程连续性，而短程连续性仍未明确。然而，这些实验并未确定A3C是否会以不同效率脱氨ssDNA中不同位置的靶标dC残基（如A3G中观察到的那样），也未探讨任何位置依赖性背后的机制基础。因此，需要定量分析以确定ssDNA中靶标位置如何影响A3C介导的脱氨基。实时NMR光谱能够直接位点分辨地监测寡核苷酸中dC向dU的转化，我们此前已利用该方法表征了A3G介导的脱氨基[6]。在本研究中，我们使用尿嘧啶-DNA糖苷酶（UDG）偶联切割测定和实时NMR光谱研究了A3C介导脱氨基的位置依赖性。UDG偶联切割测定用于比较含有不同位置靶标dC的ssDNA底物中脱氨基产物的比例。实时NMR直接监测了同一ssDNA中两个靶标dC残基的脱氨基，并提供了5′端和3′端近位靶标的表观一级脱氨基速率常数。随后，我们考虑了所观察到的位置依赖性可能的两种机制起源：5′到3′方向接近靶标时的催化速率高于3′到5′方向，这与之前对A3G提出的相反，和/或A3C沿ssDNA在5′到3′方向的滑动速率高于3′到5′方向。

章节摘要

A3C的表达与纯化

将表达全长人APOBEC3C（hA3C；后文简称A3C）作为N端谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白的pET-41a(+)表达质粒转化入Rosetta 2(DE3)pLysS大肠杆菌（Escherichia coli）细胞（Novagen）。凝血酶切割位点位于GST标签和A3C之间。凝血酶切割后，所得重组蛋白由全长人A3C组成，其前连接一个37个氨基酸的N端延伸序列（GSTAIGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTGGGSGDDDDK）。

转化后的细胞

A3C介导的脱氨基程度通常随靶标dC向ssDNA 3′端移动而增加

纯化后的重组A3C在SDS-PAGE中以约26.6 kDa为主要条带迁移（图1A）。我们使用五个5′-FITC标记的49 nt ssDNA底物进行了UDG偶联切割测定。基于A3C报道的序列偏好性[5]，选择了5′-TTCA-3′序列作为靶标序列。各底物具有相同的长度和核苷酸组成，且仅含一个相同的靶标序列，靶标dC分别位于C8、C15、C25、C34或C42（表1）。这些

结论

在本研究中，我们证明了A3C介导的脱氨基取决于靶标dC在ssDNA中的位置。UDG偶联切割测定显示，脱氨基产物比例通常随着靶标dC位置更接近ssDNA 3′端而增加。实时NMR分析显示，3′端近位C22靶标的表观一级脱氨基速率常数约为5′端近位C6靶标的2.2倍。因此，这两种

CRediT作者贡献声明

Kentaro Tozawa：撰写初稿、可视化、方法学、调查研究、形式分析、数据整理、概念化。Yudai Yamaoki：撰写审阅与编辑、方法学、调查研究、资金获取。Keisuke Kamba：撰写审阅与编辑。Takashi Nagata：撰写初稿、验证、资金获取、概念化。Masato Katahira：撰写审阅与编辑、监督指导、资金获取、概念化。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢

本研究得到了以下资助：JSPS KAKENHI资助M.K.（23H02419、23H04069和24K21946）、T.N.（23K05664）和Y.Y.（26K09220）；AMED资助M.K.（24fk0410048h0103）；大阪大学蛋白质研究所合作项目资助T.N.（NMRCR-26-10）；京都大学先进能源研究所联合使用/研究项目资助M.K.（ZE2025A-26）、T.N.（ZE2026A-18和ZE2026A-37）以及Y.Y.（ZE2026A-25）；以及京都市的ISHIZUE 2026

Kentaro Tozawa|Yudai Yamaoki|Keisuke Kamba|Takashi Nagata|Masato Katahira