乳酸菌（LAB）置换乳腺炎相关金黄色葡萄球菌（S. aureus）成熟生物被膜并诱导转录组重编程

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Transcriptomic reprogramming and displacement of mastitis-associated Staphylococcus aureus biofilms by lactic acid bacteria

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）是哺乳期急性乳腺炎的主要病原体之一，其在生物被膜（biofilm）中持续存在的能力可削弱常规抗菌治疗。乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）已成为乳腺炎管理中有前景的益生菌候选者，但其与S. aureus相互作用的分子机制仍知之甚少。本研究旨在评价三株LAB（Limosilactobacillus fermentum I7、Limosilactobacillus reuteri 7SNG3–30和Ligilactobacillus salivarius 22SNG3-30）干扰两株乳腺炎相关S. aureus菌株SA4和SA55形成的成熟生物被膜的能力，并表征相关转录响应。LAB菌株能够定植于预先形成的24 h S. aureus生物被膜，最终在混合物种群落中占优势并降低附着葡萄球菌种群。逆转录定量PCR（RT-qPCR）显示LAB暴露4 h后转录变化有限，随后16 h出现更广泛的响应，其特征在于应激/适应标志物uspA诱导，以及与群体感应、毒力、生物被膜基质产生和铁获取相关基因的抑制。对暴露于LAB 16 h的SA4生物被膜进行RNA测序（RNA-seq）分析，证实S. aureus发生广泛转录重塑，并揭示三种LAB处理间存在保守响应，包括应激、蛋白质稳态、能量代谢和精氨酸分解代谢功能激活，同时表面相关、基质相关、金属获取和毒力相关通路受抑制。相反，LAB转录组响应较为温和且具菌株依赖性，提示在生物被膜相关互作过程中存在不同代谢、营养获取和胞被适应策略。总体而言，这些发现提示这些LAB菌株能够将乳腺炎相关S. aureus从成熟生物被膜中置换，并促进其向应激适应以及毒力和持续相关功能减弱的协同转录转变。

论文解读

研究背景与科学问题：哺乳期乳腺炎是影响母乳喂养的常见疼痛性疾病，S. aureus（Staphylococcus aureus，金黄色葡萄球菌）是其主要病原之一。临床仍以经验性抗生素治疗为主，但S. aureus可在生物被膜（biofilm）中持续存在，生物被膜保护病原免受宿主免疫并降低抗菌药物渗透；生物被膜内代谢异质性和耐受亚群可降低疗效。哺乳期使用抗生素还涉及婴儿微生物群和耐药选择压力。因此，需要与母乳喂养兼容、能控制生物被膜内S. aureus的替代或补充策略。人乳环境来源LAB（lactic acid bacteria，乳酸菌）是候选益生菌；已有随机临床试验和实验研究显示部分乳杆菌可降低葡萄球菌载量、改善症状或抑制S. aureus生长和生物被膜形成，但现有证据多为表型（活菌计数、总体抗生物被膜活性或临床结局），乳腺炎相关S. aureus在生物被膜中与LAB直接互作的全局转录和分子通路仍是知识缺口。研究人员因此评价三株LAB（Limosilactobacillus fermentum I7、Limosilactobacillus reuteri 7SNG3–30、Ligilactobacillus salivarius 22SNG3-30）干扰两株急性乳腺炎相关S. aureus SA4和SA55的24 h成熟生物被膜的能力，并表征相关转录响应。主要结论是LAB能定植并逐步置换成熟生物被膜，S. aureus发生广泛转录重塑，向应激适应和毒力/持续相关功能减弱转变；LAB响应较温和且菌株依赖。其意义在于将LAB抗生物被膜表型扩展到转录层面，支持其作为削弱S. aureus生物被膜持续性的补充工具，但仍需进一步验证。

关键技术方法：采用静态体外24孔板模型，先形成24 h成熟S. aureus生物被膜，再加入约10⁵ CFU/mL活性LAB培养物，进行CFU计数时间序列及RT-qPCR检测13个S. aureus基因，以16S rRNA和gyrB为内参，采用2^?ΔΔCt法。16 h对SA4及三种LAB单种/混合生物被膜进行RNA-seq，3个生物学重复，rRNA去除后Illumina NovaSeq X Plus PE150测序，竞争比对至S. aureus USA300 FPR3757及相应LAB参考基因组，DESeq2分析DEGs（differentially expressed genes，差异表达基因；|log₂FC|>1，FDR<0.05）。样本来源：SA4、SA55分离自急性乳腺炎妇女乳汁；L. fermentum I7来自人乳；L. reuteri 7SNG3–30和L. salivarius 22SNG3-30来自早产儿鼻胃管肠内喂养管内侧表面生物被膜；未新采集样本。

研究结果：
3.1 活性LAB培养物减少成熟S. aureus生物被膜并逐步在LAB暴露群落中占优势：通过CFU计数发现，LAB暴露24 h后SA4和SA55附着S. aureus显著下降（SA4约3.05–5.19 log₁₀、SA55约4.14–4.32 log₁₀下降），LAB达到高附着量并超过残余S. aureus约3.28–5.68 log₁₀；时间序列显示LAB先增加、12–16 h后S. aureus开始下降、24 h降幅最大，故选择4 h和16 h作转录分析。
3.2 LAB暴露诱导S. aureus生物被膜细胞时间依赖转录响应：RT-qPCR显示4 h变化有限，16 h更广泛；uspA在所有组合中诱导；SA4中atl诱导，sfaA、agrB、icaA、hld、psmβ1抑制；SA55呈类似但总体较弱响应。
3.3 RNA-seq揭示SA4暴露LAB后广泛转录重塑：16 h暴露后SA4分别有776/645/585个基因上调、821/712/716个基因下调（LF/LR/LS），LAB自身响应较少且菌株依赖；PCA（principal component analysis，主成分分析）和相关性聚类区分SA4对照、LAB单种及混合生物被膜。
3.4 S. aureus对LAB暴露的共享转录响应：热图和Venn图显示588个一致下调和444个一致上调基因，形成四个模块，包括代谢与能量适应（抑制氨基酸/肽/碳源转运，诱导磷酸盐/渗透/离子稳态、糖酵解、呼吸和精氨酸脱亚胺酶arcA-D等）、表面/毒力/金属获取（抑制PNAG/PIA基质、icaABC、clfB、sdrC及cntKLM、sfaA、isdABCD、fur等，诱导sbnI/H、scdA）、胞被与应激适应（抑制肽聚糖重塑、细胞分裂、壁磷壁酸/脂磷壁酸及包膜应激，诱导抗氧化/蛋白稳态和uspA等）、调控与信息重编程（抑制mgrA、arlR等，诱导agrA/C、saeS等）。
3.5 S. aureus SA4对单一LAB菌株的配对特异和菌株特异签名：LF+LR共享上调secA2、atl、sspB/C等并抑制hlgA；LF+LS共享碳代谢、离子稳态抑制及包膜/分泌基因诱导；LR+LS共享较少。菌株特异上，LF抑制宿主互作/黏附/营养金属清除并诱导碳代谢/调控基因，LR抑制部分核苷酸/辅因子/膜功能并诱导包膜维持、代谢调整、vwb、sdrE、PSMα4，LS抑制gdpS、femA、cap8D、sarA、sbi等并诱导saeR、sarV、ctsR、hfq、cspA、trxB、recF、guaA、gyrA、ftsA、ftsZ、tagH。
3.6 RT-qPCR与RNA-seq交叉验证：两方法总体一致，尤其icaA、sfaA下调及uspA强诱导；sodA呈正趋势，atl一致，sarA和esaA变化较小或菌株依赖；总体方向性保留，支持16 h转录响应的稳健性。
3.7 LAB与S. aureus SA4生物被膜互作中的转录组响应：三株LAB均定植并参与置换，但LAB响应较S. aureus温和且菌株依赖；LF上调翻译、核苷酸、营养转运、表面/包膜适应和辅因子/氧化还原功能，LR上调核苷酸合成、营养获取、翻译、表面适应和氧化还原，LS响应更有限，主要上调山梨醇/葡萄糖醇转运调控和fbp，下调碳水化合物转运代谢及应激/调控/移动分泌相关基因。

讨论部分总结：讨论指出，S. aureus在乳腺导管黏附并形成生物被膜导致治疗失败；本研究中LAB先定植成熟生物被膜并渐进占优、S. aureus下降滞后，提示为竞争性转换而非即时杀菌，LAB拮抗涉及营养竞争、分泌抑制物、直接互作及表面/基质/代谢改变。RT-qPCR中agrB、hld、psmβ1下调与干扰群体感应（quorum sensing，QS）的抗毒力策略一致，但agr在生物被膜中作用复杂需谨慎；icaA下调提示PNAG/PIA（poly-β-(1,6)-N-acetylglucosamine/polysaccharide intercellular adhesin，聚-β-(1,6)-N-乙酰葡糖胺/多糖胞间黏附素）基质投资减少，sfaA下调提示铁载体分泌/铁清除改变，uspA诱导提示一般应激适应。RNA-seq确认核心响应，显示LAB施加生态压力，使SA4抑制经典生物被膜/表面/毒力功能并转向应激适应生存；核心之外存在LAB菌株依赖签名。需考虑S. aureus生物被膜异质性和bulk RNA-seq的群体聚合性质，16 h为过渡阶段。LAB响应较温和且菌株依赖，但对照为单种LAB生物被膜，已活跃功能未必显示为差异；LS在16 h可能已建立优势、接近稳态。局限包括静态体外模型、RNA-seq仅SA4 16 h、使用参考基因组而非菌株特异基因组、转录变化不等同代谢物或因果；未来需时间分辨RNA-seq、代谢组、pH控制、纯化代谢物及宿主细胞/动物/临床验证。

研究结论（翻译）：本研究表明，受试三株LAB能够定植并逐步置换由两株乳腺炎相关菌株SA4和SA55形成的预形成S. aureus生物被膜。该抗生物被膜效应并非即时，而是遵循时间依赖的竞争性转换：LAB先在生物被膜内建立，随后附着葡萄球菌种群下降。对SA4和SA55的靶向RT-qPCR显示时间依赖转录响应，通常在LAB暴露16 h后及SA4中更明显。暴露16 h后对SA4进行的RNA-seq揭示广泛转录重塑，包括与群体感应、毒力、基质产生、表面相关性状和金属获取相关的基因和通路受抑制，同时应激、能量和蛋白稳态相关功能激活。三种LAB暴露在SA4中诱导共享转录响应，同时每个LAB-SA4互作也显示配对特异转录签名。相反，LAB菌株的转录组响应较温和且具菌株依赖性。受试菌株中，L. salivarius 22SNG3–30显示尤其有前景的表型特征，包括快速生物被膜定植、高附着细胞数和较早降低S. aureus SA4种群。然而，这些体外发现不能证明临床疗效，所测试LAB菌株用于乳腺炎相关应用的潜力需在宿主细胞和动物模型中进一步验证，随后开展良好对照的临床研究。总体而言，这些发现支持进一步研究LAB作为削弱急性哺乳期乳腺炎背景下S. aureus生物被膜持续性的潜在补充工具。