EGFR通过结合PEDV刺突蛋白并调控内体/溶酶体转运促进病毒内化

《Frontiers in Veterinary Science》：EGFR promotes PEDV internalization via spike protein association and endo?/lysosomal trafficking

　　

引言：猪流行性腹泻病毒（PEDV）可导致哺乳仔猪发生严重急性腹泻、呕吐、脱水和高死亡率，给全球养猪业造成重大经济损失。既往研究报道，表皮生长因子受体（EGFR）可通过调控JAK-STAT（Janus激酶-信号转导与转录激活因子）I型干扰素轴促进PEDV感染。然而，EGFR在病毒进入早期阶段的具体作用仍不清楚。方法：本研究构建了EGFR敲除（KO）Vero细胞系。采用免疫共沉淀（Co-IP）、病毒附着和内化实验以及共聚焦共定位分析，研究EGFR在PEDV进入过程中的作用。结果：发现PEDV刺突（S）蛋白与EGFR结合。EGFR敲除部分损害病毒内化，而病毒附着未受影响。进一步共定位分析显示，PEDV在早期内体、晚期内体和溶酶体中与EGFR共定位，且EGFR敲除损害PEDV与晚期内体的共定位。讨论：EGFR被鉴定为宿主辅因子。其通过促进病毒内化和易化内化后内体/溶酶体（endo?/lysosomal）转运来支持PEDV感染。该工作拓展了对冠状病毒进入途径的认识。

研究背景与问题：猪流行性腹泻病毒（PEDV）为有包膜单股正链RNA病毒，属冠状病毒科α冠状病毒属，基因组约28 kb，编码刺突（S）、包膜（E）、膜（M）和核衣壳（N）等结构蛋白；S蛋白约150–220 kDa，是介导病毒附着和细胞进入的关键表面糖蛋白。PEDV引起各年龄猪急性水样腹泻、呕吐和脱水，对哺乳仔猪尤其严重且常致死，造成全球养猪业重大经济损失。基于S基因系统发育，PEDV分为G1和G2，G2为猪群主要流行株。受体识别和细胞进入机制是研究重点。早期研究提出猪氨基肽酶N（pAPN）可能为PEDV受体，但后续证据矛盾：Vero细胞对PEDV易感却不表达APN，APN敲除猪仍易感，提示PEDV可能利用替代或额外宿主因子。已报道SIGLEC-15、FSTL1/TLR4等参与病毒吸附。EGFR为受体酪氨酸激酶家族成员，是多种病毒的重要宿主因子；既往报道EGFR激活或过表达可通过抑制JAK-STAT通路介导的先天免疫促进PEDV感染，但EGFR在PEDV早期进入及胞内转运中的作用尚未研究。因此，研究人员开展本研究。研究开展与结论：研究人员构建EGFR敲除（KO）Vero细胞，结合分子对接、免疫共沉淀（Co-IP）、病毒附着/内化实验、EGFR回补/过表达和共聚焦共定位，发现EGFR与PEDV S蛋白结合；EGFR对病毒附着非必需，但促进病毒内化并影响内化后内体/溶酶体转运，尤其影响PEDV与晚期内体共定位。意义：将EGFR定位为PEDV进入的宿主辅因子，拓展了对冠状病毒进入机制的认识。

关键技术方法（不超过250字）：采用CRISPR构建EGFR-KO Vero细胞系，以Western blot和Sanger测序验证；以AlphaFold3预测猪EGFR结构、HDOCK进行PEDV S–EGFR对接；Co-IP检测内源结合；4 °C同步附着、37 °C启动内化并行酸性洗脱，用RT-qPCR（逆转录定量PCR）和Western blot定量附着/内化；间接免疫荧光（IFA）和共聚焦三色免疫荧光检测PEDV S/N与EGFR及EEA1（早期内体抗原1）、RAB7（Ras相关蛋白Rab-7）、LAMP1（溶酶体相关膜蛋白1）共定位，以秩加权共定位系数（RWC）定量；并进行EGFR回补和过表达。Vero细胞购自中国科学院细胞库；PEDV HB株（GenBank登录号KY928065.1）由研究人员实验室分离保存。

研究结果：
3.1 EGFR与PEDV S蛋白结合：分子对接显示PEDV S与EGFR对接得分为?282.96，提示潜在结合；在PEDV感染Vero细胞中，Co-IP双向拉下EGFR与PEDV S蛋白，正常IgG未拉下二者。结论为PEDV S蛋白与EGFR在感染细胞中结合。
3.2 EGFR参与PEDV早期感染：研究人员构建并验证EGFR-KO Vero细胞；以0.1 MOI感染后4和6 hpi，RT-qPCR显示PEDV N基因拷贝数显著低于野生型（WT）细胞；6 hpi IFA显示PEDV S蛋白荧光强度降低。结论为EGFR对PEDV早期高效感染是必需的。
3.3 EGFR不影响PEDV与细胞表面的附着：4 °C处理2 h同步附着后，共聚焦见部分PEDV S与EGFR在质膜共定位；WT与EGFR-KO细胞的细胞结合病毒RNA和PEDV N蛋白无显著差异；抗EGFR胞外域抗体12.5和25 μg/mL不降低细胞相关病毒RNA。结论为EGFR对PEDV附着非必需。
3.4 EGFR参与PEDV内化：4 °C附着后转至37 °C 1 h，PEDV S与EGFR仍共定位；EGFR-KO细胞内PEDV N mRNA和蛋白降低；回补EGFR可部分但显著恢复内化，WT细胞过表达EGFR显著增加内化。结论为EGFR促进PEDV内化，KO细胞内化缺陷可归因于EGFR缺失。
3.5 EGFR参与PEDV胞内转运：内化后30、40和50 min，三色免疫荧光显示EGFR与PEDV S/N在EEA1⁺、RAB7⁺和LAMP1⁺区室共定位；RWC定量显示EGFR-KO显著降低PEDV S/N与RAB7共定位，而与EEA1和LAMP1共定位无显著差异。结论为EGFR为PEDV与晚期内体共定位所需。

讨论总结：研究人员将EGFR鉴定为PEDV进入的宿主辅因子，使用G2流行株，证明其与S蛋白结合并与病毒蛋白在附着、内化和胞内转运中共定位；功能上EGFR对附着非必需，但促进内化并影响PEDV与晚期内体共定位。附着期共定位在KO和抗体阻断实验中表现短暂，作者认为EGFR可能预置病毒进入而非作为稳定附着受体；该模式与TGEV中EGFR结合S蛋白后磷酸化并与pAPN复合触发内吞信号、SARS-CoV-2中EGFR经MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）增强受体介导内吞的观察一致。内运方面，EGFR-KO破坏PEDV与晚期内体共定位而早期内体和溶酶体共定位无显著变化；作者讨论一种可能解释是EGFR-KO Vero细胞中补偿性替代内吞途径可将病毒粒子直接递送至溶酶体而绕过经典RAB7⁺晚期内体，但该可能尚未证实。局限为所有实验均在Vero细胞中完成，Vero非PEDV自然靶细胞，需猪源细胞验证；Vero缺乏功能性干扰素反应，故EGFR依赖的进入机制不能归因于既往提出的EGFR-JAK/STAT-IFN（干扰素）通路。作者提出三种假设：EGFR内在酪氨酸激酶活性调节内体性质；EGFR近膜域识别冠状病毒包膜暴露的磷脂酰丝氨酸（PS），PS受体家族TIMs和TAM（TYRO3、AXL、MERTK）可促进SARS-CoV-2进入；EGFR与内体运输蛋白互作。未来可用EGFR激酶失活突变体回补、PS阻断和Co-IP筛选内体蛋白互作验证。

研究结论部分翻译：本研究证明，EGFR通过与PEDV S蛋白结合促进病毒内化和晚期内体转运，为PEDV进入宿主细胞提供支持。该研究为冠状病毒复杂的进入机制提供了新见解。