供者血液TLR9在小鼠炎症诱导的输血红细胞同种抗原免疫应答中的必要性

《Frontiers in Immunology》：TLR9 is required in donor blood for inflammation-induced immunization to an alloantigen on transfused RBCs in mice

　　

输注红细胞（RBCs）上的同种抗原引发的体液免疫仍然是慢性输血患者安全有效输血的主要障碍。然而，只有部分患者在多次输血后会发生同种免疫。首先在小鼠中观察到，随后在人类中得到证实，输血时受者的炎症状态会增加RBC同种免疫的发生率。病毒双链RNA已被广泛研究，并通过激活受者MAVS（线粒体抗病毒信号蛋白）及后续诱导α-干扰素来增强同种免疫。然而，尚未有研究报告检测先天免疫受体在供者细胞中的作用。在此，研究人员报告称，受者暴露于另一种先天免疫激活剂CpG会以TLR9依赖的方式增强对输注RBCs的同种免疫。此外，TLR9在输注的供者细胞和受者中均不可或缺。据研究人员所知，这是首次报道输注RBCs上的先天免疫受体调控RBC同种免疫。除了为RBC同种免疫的机制图谱增添新的概念性组分外，这些发现还提出了通过选择已知携带低效TLR9基因变体的供者RBC单位，或在供者血液中引入TLR9拮抗剂来降低RBC同种免疫的可能性。

论文解读文章

研究背景与目的

在临床输血实践中，针对输注红细胞（RBCs）表面同种抗原产生的体液免疫（即RBC同种免疫）是一个严峻的医学难题。部分患者在接受多次输血后会逐渐产生针对多种同种抗原的抗体，而另一些患者即使接受数百次输血也未能检测到任何同种抗体。这种“应答者”与“非应答者”模式的差异机制尚不完全清楚，被领域内确定为研究重点。理解调控RBC同种免疫的致病因素，不仅能为特定患者的输血管理提供即时帮助，也能为开发治疗干预措施奠定理性基础。

已有研究在人类和小鼠模型中证实，输血时受者的炎症状态是RBC同种免疫的主要调控因子。炎症和先天免疫激活由微生物中特有的化学基序（即病原体相关分子模式，PAMPs）诱导。两种广泛研究的PAMPs是双链RNA（dsRNA）和CpG，分别存在于病毒和细菌的生命周期中。先前的研究表明，受者在输血前暴露于dsRNA或流感病毒，可通过MAVS信号通路及随后的I型干扰素诱导，显著增强多个小鼠同种抗原模型中的抗体反应。人类研究也证实输血时的病毒血症与同种免疫增加相关。此外，不同先天免疫调节剂对RBC同种免疫的影响存在差异：dsRNA增强免疫，而脂多糖（LPS）则抑制免疫。Yu等人已证明细菌DNA基序CpG也能增强RBC同种免疫。Mangalmurti等人近期报道了Toll样受体9（TLR9）在人和小鼠RBCs上均有表达，并且小鼠RBCs上的TLR9会影响对CpG的先天免疫反应。由于TLR9是哺乳动物中CpG的主要受体，但其在CpG诱导的RBC同种免疫中的作用尚未被评估。因此，研究人员假设供者RBCs上的TLR9会影响适应性体液同种免疫。

主要技术方法

本研究使用了基于C57BL/6背景的HOD转基因小鼠，其RBCs特异性表达由鸡卵清溶菌酶（HEL）、卵清蛋白（OVA）C端一半和人Duffy抗原组成的融合蛋白作为模型同种抗原。通过将HOD小鼠与TLR9基因敲除（TLR9^-/-）小鼠杂交，产生了同时表达HOD抗原且缺失TLR9的供者小鼠（HODxTLR9^-/-）。输血实验采用尾静脉注射方式，向受者小鼠输注相当于人体1单位RBC生理等效量的50微升压积RBCs。在输血前2小时，受者小鼠腹腔注射磷酸盐缓冲液（PBS）或50微克CpG ODN1856以模拟炎症环境。通过流式细胞术交叉配型法测量血清中的抗HOD同种抗体，具体为使用HOD阳性或阴性靶RBCs孵育血清，再以荧光标记二抗检测，计算调整后的平均荧光强度（MFI）。所有受者小鼠均为雌性，8-12周龄，实验经弗吉尼亚大学动物护理和使用委员会批准。

研究结果

CpG增强的抗HOD IgG应答依赖于受者TLR9

实验方案如图1A所示。结果显示，CpG预处理未显著改变第7天的抗HOD IgM水平。但在第21天，CpG预处理使抗HOD IgG水平相比对照组增加了5.4倍。当使用TLR9^-/-小鼠作为受者时，CpG增强抗HOD IgG同种抗体的能力完全消失，而IgM反应仍无显著变化。这表明CpG诱导的同种免疫增强效应依赖于受者体内的TLR9。

CpG增强的抗HOD IgG应答依赖于供者RBCs上的TLR9

为测试供者RBCs上TLR9的作用，研究人员利用流式细胞术确认了HODxTLR9^+/+和HODxTLR9^-/-供者RBCs上TLR9的表达差异，并确认TLR9缺失不影响HOD抗原的表达水平。实验方案如图2C所示，野生型B6受者接受CpG处理后，分别输注来自HODxTLR9^+/+或HODxTLR9^-/-供者的血液。结果表明，两组在第7天的IgM反应无显著差异。但在第21天，接受HOD⁺TLR9^-/- RBCs输注的受者，其CpG诱导的抗HOD IgG水平显著低于接受HOD⁺TLR9^+/+ RBCs的受者。通过综合7次独立实验的数据，计算CpG处理组相对于PBS对照组的倍数变化，进一步证实了HOD⁺TLR9^-/-供者血引起的抗HOD IgG反应显著更低。

讨论与结论

本研究的核心发现是首次确定了TLR9是CpG诱导的RBC同种免疫中的一个响应元件。尽管基于常识可能认为dsRNA和CpG分别通过TLR3和TLR9发挥作用，但此前已证明dsRNA并非通过TLR3，而是通过MAVS和干扰素途径起作用。本研究则明确显示CpG的作用依赖于TLR9。更重要的、出乎意料的发现是，供者血液中的TLR9对于CpG增强的RBC同种免疫也是必需的。这扩展了当前关于先天免疫调控RBC同种免疫的范式，将焦点从仅关注受者生物学拓展到了供者生物学。

研究人员提出了几种符合已知免疫学原理的工作假说来解释这一现象。其一，B细胞对RBC表面抗原的特异性内吞作用，可能同时将结合在RBC上的CpG带入胞内，从而同步激活B细胞受体（BCR）和位于内涵体中的TLR9，促进B细胞活化。其二，浆细胞样树突状细胞（pDCs）通过吞噬结合了CpG的RBCs，使其内部的TLR9被激活，进而提呈抗原肽-MHC-II复合物给CD4⁺ T细胞，或通过细胞接触和细胞因子直接辅助B细胞。其三，TLR9表达可能影响RBC清除率，从而间接影响抗原呈递，但现有数据（TLR9缺失导致清除率下降和免疫反应减弱）与该假说预测相反。

研究也存在局限性。由于使用的是全身性TLR9敲除小鼠而非RBC特异性条件性敲除，无法完全排除供者血液中少量白细胞或血小板贡献的可能性。尽管如此，鉴于HOD抗原特异性地表达在RBCs上，研究结果强烈指向RBC表达的TLR9在其中的关键作用。

研究结论指出，这些发现在多个层面具有重要意义。首先，它首次将先天免疫受体在供者细胞中的作用纳入RBC同种免疫的考量范畴，可能对理解母体对胎儿RBCs的免疫机制也有启示。其次，若该发现能在人类中得到转化验证，将具有实际应用价值：例如，可根据人类供者中存在的TLR9多态性来选择免疫原性较低的RBC单位用于高危患者（如镰状细胞病、骨髓增生异常综合征患者）；或在体外培养RBCs时，有意操控其先天免疫受体以制备低免疫原性的血制品；亦或在输血前向血液中添加特定的TLR9拮抗剂。总之，本研究确立了供者血液中TLR9在CpG诱导的RBC同种免疫中的新需求，将输血诱导的同种免疫反应的研究焦点从受者转向了供者。