基于AuNPs@MBene-TFT仿生人工舌的非侵入性唾液microRNA-27a高灵敏检测用于头颈鳞状细胞癌评估

《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：A biomimetic AuNPs@MBene-TFT artificial tongue for sensitive non-invasive salivary microRNA-27a detection in HNSCC assessment

　　

：头颈鳞状细胞癌（HNSCC）仍是重大临床挑战，凸显了对灵敏且非侵入性的唾液生物标志物检测策略的需求。唾液microRNA-27a是有前景的生物标志物候选物，但其实际检测受限于当前平台的灵敏度与集成度。研究人员开发了一种基于AuNPs@MBene功能化薄膜晶体管（TFTs）的仿生人工舌，用于唾液中microRNA-27a的高灵敏检测。AuNPs@MBene纳米复合材料通过水热法合成，金纳米颗粒（AuNPs）修饰于层状MBene表面，为探针固定和信号转导提供纳米结构化界面。经对DNA捕获探针浓度、孵育时间、pH和温度的系统优化，确定最佳条件分别为40 μM、30 min、pH 7.0和37 °C。该器件表现出良好的稳定性，30天后信号衰减仅为1.12%；重现性高，批次间相对标准偏差（RSD）为1.21%。其线性检测范围为10 fM至1 nM，R2 = 0.9886，检测限（LOD）为3.2 fM。进一步构建了64通道阵列，实现空间分辨和时间依赖的目标监测。在初步临床评估中，该平台可区分11例健康对照和13例HNSCC患者的唾液样本，p = 0.00027，受试者工作特征曲线下面积（AUC）为0.901。上述结果表明，AuNPs@MBene-TFT人工舌在非侵入性唾液microRNA检测及HNSCC相关生物标志物分析方面具有应用潜力。

论文解读文章：

一、研究背景与问题

头颈鳞状细胞癌（HNSCC）是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率持续居高不下，严重威胁人类健康。HNSCC相关生物标志物评估与精准监测是改善患者预后和生存率的关键，而识别具有高特异性和高灵敏度的肿瘤标志物是实现高效评估的重要突破口。尽管治疗手段不断进步，HNSCC的预后仍然较差，主要原因在于诊断偏晚、组织活检具有侵入性，以及缺乏灵敏、非侵入性的筛查工具用于早期检测和实时监测。这些临床挑战凸显了对易获取的生物标志物和高性能检测平台的迫切需求。

microRNA-27a作为一种重要的非编码RNA，在HNSCC的发生、发展、侵袭和转移中发挥关键调控作用，其表达水平在患者中显著异常，已被报道为HNSCC相关评估中具有前景的分子标志物候选物。传统HNSCC诊断依赖组织活检和影像学检查等侵入性或复杂方法，存在操作不便、患者依从性差、早期检出率低等缺点。唾液作为一种易获取且非侵入性的生物体液，富含蛋白质和核酸等生物标志物，其中microRNA-27a的分泌水平与疾病状态密切相关，为非侵入性检测提供了理想的样本来源。

与仅能提供平均体相浓度的单通道生物传感器不同，64通道人工舌能够捕获空间异质性——这在临床上具有重要意义，因为单侧HNSCC肿瘤会产生区域性的唾液miRNA梯度，而单点采样不可避免地会遗漏这些信息。薄膜晶体管（TFTs）作为人工舌的核心检测单元，能够实现高灵敏检测和系统集成，其性能直接取决于半导体材料的选择。MBene具有优异的电子迁移率、良好的生物相容性和独特的层状结构，是理想的半导体基底。金纳米颗粒（AuNPs）可均匀附着于MBene片层表面，进一步加速电子转移并提高检测灵敏度。

基于上述考虑，研究人员旨在开发并评估一种基于AuNPs@MBene-TFT的人工舌平台，用于与HNSCC相关的非侵入性唾液microRNA-27a高灵敏检测。与依赖标记的电化学/光学传感器以及缺乏空间映射能力的传统场效应晶体管（FETs）不同，该无标记64通道TFT人工舌在实现3.2 fM检测限（信噪比S/N = 3.0）的同时，能够独特地绘制唾液miRNA的局部梯度分布——这是首个专门针对HNSCC异质性设计的高通道人工舌。

二、研究内容与结论

该研究开发了基于AuNPs@MBene-TFT的仿生人工舌平台，实现了对唾液中microRNA-27a的高灵敏、非侵入性检测。AuNPs@MBene复合材料提供了功能化的纳米结构界面，用于探针固定和晶体管信号转导。经系统优化后，传感器表现出良好的稳定性、重现性、特异性、10 fM至1 nM的宽线性检测范围以及3.2 fM的低检测限。传感平台进一步集成为64通道人工舌阵列，实现了microRNA-27a的并行和空间分辨监测。时间依赖的信号映射表明，该阵列能够捕获多个传感位点的动态变化，凸显了其在多位点唾液生物标志物分析方面的潜力。对健康个体和HNSCC患者临床唾液样本的初步检测显示，两组之间存在显著差异，AUC达0.901。这些结果表明，AuNPs@MBene-TFT人工舌是非侵入性唾液microRNA检测和HNSCC相关生物标志物评估的有前景平台。

三、主要关键技术方法

研究人员首先采用氢氧化钠刻蚀法制备层状MBene，利用经典柠檬酸钠还原法制备金纳米颗粒（AuNPs），再通过水热法在120 °C下反应12 h合成AuNPs@MBene复合材料。随后将该复合材料分散于无水乙醇中，滴涂于预溅射金源/漏电极的硅/二氧化硅晶圆薄膜晶体管芯片（沟道长度50 μm，宽度1000 μm，宽长比W/L = 20）的沟道区域，形成敏感薄膜。通过Au-S键自组装将microRNA-27a特异性DNA捕获探针（序列：5′-SH-(CH₂)₆-GCGGAACTTAGCCACTGTGAA-3′）固定于敏感膜表面，并用巯基己醇封闭非特异性结合位点。传感单元进一步扩展为8 × 8排列的64通道阵列，集成于定制印刷电路板上，构成多通道人工舌系统。临床样本来自11例健康志愿者和13例经病理确诊的HNSCC患者（伦理批准号AF-HEC-2025022805），唾液样本于清晨空腹采集，离心取上清后于?80 °C保存待测。

四、研究结果

1. 1.
   材料表征结果

通过扫描电子显微镜观察，二维金属配合物前驱体呈现多层堆叠形貌，为后续表面修饰提供了层状框架。Au纳米颗粒功能化后，MBene表面观察到大量纳米颗粒，形成AuNPs@MBene杂化结构，保留了片状形貌的同时引入了纳米尺度的Au修饰，有利于增加可及的传感界面。元素映射分析检测到Al、B、Mo特征元素在材料区域内的均匀空间分布，证实了MBene基结构的成功形成和组分均匀性，表明AuNPs成功与MBene基体整合，为后续生物传感实验提供了合适的纳米结构界面。

1. 2.
   实验参数优化结果

以目标加入前后源漏电流相对变化（ΔI/I₀）为评价指标，对DNA捕获探针浓度、孵育时间、pH和孵育温度四个关键参数进行系统优化。响应信号在探针浓度为40 μM时达到最大值，进一步增加探针浓度未产生更高响应，提示过量探针负载可能部分阻碍界面电荷调制。信号随孵育时间延长而增加，在30 min时达到平台期，表明结合过程接近平衡。在pH 4–9范围内，pH 7时信号最高，说明近中性环境有利于维持核酸杂交效率和传感层界面稳定性。在32 °C–45 °C范围内，37 °C时器件响应最强，与生理相关检测条件一致。最终确定最佳条件为：探针浓度40 μM、孵育时间30 min、pH 7、孵育温度37 °C。

1. 3.
   传感器性能表征结果

稳定性测试显示，器件在4 °C密封干燥环境中储存1个月后，信号仅衰减1.12%，表明传感界面在储存期间保持了良好的功能稳定性。批次间重现性评估中，五批独立制备器件的相对标准偏差（RSD）仅为1.21%，表明制备过程具有良好的可重复性和均匀性。特异性测试中，器件对目标microRNA-27a的响应显著高于错配序列、非同源miRNA和空白缓冲液，证实传感响应主要源于对目标microRNA-27a的特异性识别而非非特异性吸附。定量检测能力测试显示，在10 fM至1 nM浓度范围内，响应信号与目标浓度呈良好线性关系，相关系数R² = 0.9886，计算检测限（LOD）为3.2 fM（S/N = 3.0）。在加标健康唾液中的回收率为98.5%–101.2%，RSD = 1.31%，确认了该传感器在临床应用中的分析可靠性。

1. 4.
   人工舌初步应用结果

64通道器件成功记录了多个传感位点的响应，每个通道均显示独立的信号输出，表明阵列能够进行并行检测而非依赖单一测量点。在体外舌模型上，于T0（滴加前）、T1（滴加后15 min）、T2（滴加后30 min）三个时间点连续记录各通道响应信号，空间信号模式在目标引入后随时间发生变化，表明该阵列能够捕获microRNA-27a信号在传感表面的空间变化和时间演变。与单点检测相比，64通道人工舌提供了更多空间信息，可实现局部信号差异的可视化，在多通道、时间依赖和空间分辨的唾液生物标志物分析方面具有应用潜力。

1. 5.
   临床性能验证结果

对11例健康对照和13例HNSCC患者的唾液样本进行检测，HNSCC组获得的检测信号显著高于健康对照组。t检验统计分析显示两组间差异显著，p = 0.00027，表明该器件检测到的唾液microRNA-27a在HNSCC患者组中较健康个体升高。ROC曲线分析显示曲线下面积（AUC）达0.901，表明基于器件响应可良好区分健康对照与HNSCC患者。鉴于当前队列样本量有限，这些临床结果应视为初步验证，仍需更大规模的独立队列和详细的临床分层来进一步验证该器件的诊断稳健性和普适性。

五、讨论部分总结

在复合材料优化方面，当前工作的材料表征相对有限，溅射涂层Au与AuNPs的重叠妨碍了通过EDS对Au负载的确定性确认，且不完全刻蚀残留的Al未被完全消除。临床验证在小型队列中进行，未与qRT-PCR进行比较，唾液基质组分对传感器响应的潜在干扰需进一步系统研究。未来可探索MBene与其他二维材料（如MoS₂、石墨烯）组成的三元复合体系，或引入金属有机框架（MOFs）和导电聚合物等功能材料，以实现更高的载流子迁移率和更丰富的活性位点。调控AuNPs的尺寸、形貌和负载密度，或采用掺杂和表面官能团修饰策略，可进一步优化界面电子转移效率，实现对更低丰度肿瘤标志物的超灵敏检测。

在人工舌系统集成与智能化方面，当前64通道人工舌已初步验证了多位点并行监测能力。未来应聚焦系统小型化和便携化，例如将传感器阵列与柔性电路、无线传输模块和智能手机终端集成，构建即时检测（POCT）设备。引入机器学习算法对多通道信号进行模式识别和分类分析，有望实现对HNSCC不同分期或亚型的智能判别。该平台还可扩展至其他口腔疾病（如牙周炎和口腔癌前病变）生物标志物的多重检测。

在唾液样本前处理标准化和大规模临床验证方面，当前临床数据来自相对较小的队列，结果应视为初步发现。唾液成分复杂，黏蛋白等干扰物质可能影响长期检测稳定性。未来可开发集成微流控芯片，在检测前对唾液进行在线过滤、稀释或目标富集，进一步提高可靠性。同时需要进行多中心、大样本前瞻性临床研究，建立基于microRNA-27a检测的健康人群参考区间和诊断临界值，并评估该人工舌在HNSCC术后复发监测、疗效评估和高危人群筛查中的真实临床价值。本研究的局限性包括：单中心小队列（n = 24）、缺乏独立验证和qRT-PCR比较、基质干扰测试有限、依赖单一生物标志物、依赖实验室样本制备和台式仪器。未来需要更大规模的多中心验证、多重生物标志物组合和微型化便携读出系统来解决这些局限，实现即时检测转化。

六、研究结论翻译

本研究中，研究人员开发了一种基于AuNPs@MBene-TFT的仿生人工舌，用于非侵入性唾液microRNA-27a检测。AuNPs@MBene复合材料为探针固定和基于晶体管的信号转导提供了功能性纳米结构界面。经系统优化后，传感器表现出良好的稳定性、重现性、特异性、10 fM至1 nM的宽线性检测范围和3.2 fM的低检测限。传感平台进一步集成为64通道人工舌阵列，实现了microRNA-27a的并行和空间分辨监测。时间依赖的信号映射表明，该阵列能够捕获多个传感位点的动态变化，凸显了其在多位点唾液生物标志物分析方面的潜力。对健康个体和HNSCC患者临床唾液样本的初步检测显示，两组之间存在显著差异，AUC为0.901。这些结果表明，AuNPs@MBene-TFT人工舌是非侵入性唾液microRNA检测和HNSCC相关生物标志物评估的有前景平台。仍需在更大规模和独立的临床队列中进行进一步验证，以确认其诊断稳健性和实际适用性。