《Journal of Hazardous Materials》：Molecular Impairment-Guided Ecotoxicity Assessment: Insights from Copper and pH Stress in Zebrafish
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•新识别出一个9小时的分子峰值窗口来调控铜毒性。•酸性环境独特地引发了最严重的层级性通路损伤。•pH变化从根本上重塑了分子损伤通路的分级格局。•分子损伤的评估有助于在波动环境中进行毒性评价。引言传统生态毒性评估严重依赖于宏观的生化与生理终点指标，例如氧化应激以及通过电嗅觉图检
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新识别出一个9小时的分子峰值窗口来调控铜毒性。
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酸性环境独特地引发了最严重的层级性通路损伤。
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pH变化从根本上重塑了分子损伤通路的分级格局。
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分子损伤的评估有助于在波动环境中进行毒性评价。
引言
传统生态毒性评估严重依赖于宏观的生化与生理终点指标，例如氧化应激以及通过电嗅觉图检测到的嗅觉功能障碍[1]、[2]。然而，这些后期表型反应往往滞后于其初始的分子扰动[1]。此外，难以捕捉毒性的起始机制及长期低剂量暴露的潜在危害，导致无法在复合污染条件下准确评估毒性[3]。早期研究表明，基因组学方法在确定操控水化学条件下（如Ca2?）慢性铜毒性的转录终点方面具有实用性，为高通量、以分子和机制为基础的毒性评估提供了可能[4]。随着组学技术的进步和成本的降低，转录组学被用于识别污染物触发的最敏感生物通路。通过基于通路响应性对有毒物质进行优先级排序，该方法提供了一种高效且经济可行的工具，已成功应用于识别新型神经毒性和心血管干扰化学物质[5]、[6]、[7]。转录组学指导的结局预测（T-GOP）有效识别了OBS诱导的认知障碍，并对敏感终点进行了优先级排序以供验证[8]。一个将转录组扰动关键事件谱映射至不良结局通路（AOP）网络的框架被开发出来，以阐明斑马鱼胚胎的浓度依赖性行为结局[9]。这些研究聚焦于核心分子通路而非穷尽的通路集。然而，它们并未明确定义这些核心通路的组成。本研究以铜和pH作为研究模型，聚焦于铜毒性分子开关的时间动态以及靶器官内关键通路的改变，以评估铜的生态毒性。
水化学变化（如pH、溶解有机碳和硬度阳离子）对鱼类急性铜毒性的影响已被系统筛查，这对于建立场地特异性铜水质标准至关重要[10]。在自然环境中，鱼类更频繁地暴露于低剂量、长期的慢性铜污染，因此将当前框架推广至慢性生物配体模型（BLM）构成了一项主要挑战[4]、[11]、[12]、[13]。铜的生态毒理学评估越来越关注鱼类鳃部的氧化还原动态而非总浓度[14]、[15]。STEAP依赖性膜蛋白和FDX1驱动的胞内氧化还原开关介导的鳃-水界面Cu(II)还原为Cu(I)，作为铜生物可利用性的关键门户[15]。然而，这些分子"守门人"对环境扰动（如pH胁迫）的动态响应性仍是一个瓶颈[16]。我们之前的研究发现，在铜暴露72小时后，steap4连同铜转运基因slc31a和cox17在特定的斑马鱼鳃细胞群体中（如基质、内皮细胞、鳃软骨和支柱细胞）显著上调，这是9小时峰值分子开关或早期分子启动事件的下游细胞和组织水平不良结局[17]。尽管有这些空间见解，但目前在后期暴露阶段（如72小时）获取的转录组快照未能捕捉到铜毒性分子开关的时间动态，即铜氧化还原转化的峰值窗口。表征波动水pH下氧化还原基因表达的精确时间峰值对于阐明早期毒性机制至关重要。这些高度敏感和早期响应的转录组学终点超越了传统生理指标，为提高BLM的预测准确性提供了可行策略。
为应对上述局限性，本研究提出了一个组学驱动的框架来解决波动水化学条件下的铜毒性问题，旨在超越传统生理终点和BLM的固有局限。通过系统探究关键氧化还原开关基因steap家族和fdx1在斑马鱼鳃内的时间表达动力学，我们识别出一个9小时的"分子峰值窗口"，作为铜毒性初始诊断的高敏感性特征标志。我们进一步证明，环境pH波动通过改变该氧化还原开关的动力学幅度和时间触发来调节毒性。结合BCS介导的Cu(I)螯合实验，我们验证了一个pH依赖的遗传毒性景观，捕捉到传统生物标志物难以察觉的亚致死分子扰动。此外，我们建立了毒理学靶标通路的分级分类体系，以阐明水化学波动与铜污染相互作用所产生的联合胁迫强度。在一定程度上，我们的发现提供了一种比传统监测方案具有更高敏感性和精确度的基于分子动力学的精细预测工具，为复杂动态环境中金属污染的风险评估提供了坚实的机制基础。
章节摘要
化学试剂
用于选择性可视化Cu(I)的荧光探针Copper Fluor-4（CF4）由美国加州大学伯克利分校Christopher J. Chang教授惠赠。CF4在斑马鱼中的特异性和成像性能在我们的先前研究中已得到严格验证[15]、[16]、[18]。五水合硫酸铜（CuSO?·5H?O）、二甲基亚砜和4%多聚甲醛购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。基于二甲苯的抗褪色封片剂
铜胁迫下铜毒性分子开关的分子动力学与峰值窗口
在我们先前的研究中，我们使用标准的72小时延长暴露时长，探索了斑马鱼鳃细胞对铜胁迫的全局毒性反应景观[15]。暴露于环境相关剂量的铜后，在鱼类鳃软骨中发现了steap4的显著上调，表明铜毒性分子开关控制了铜毒性的激活。然而，铜毒性分子开关的激活本质上是一个早期事件，在逻辑上应先于下游的
铜和pH胁迫下的损伤通路分级
为进一步通过分子水平的改变评估毒理学损伤的严重程度，我们在不同pH和铜暴露后进行了KEGG通路富集分析。与依赖形态学、生理学和生化指标的传统毒性评估不同，我们直接根据特定通路的改变来定义组织损伤的严重程度。这些毒性反应的分级排序如下：坏死性凋亡 > 铁死亡 > 凋亡 >
Cu(I)螯合剂BCS对通路水平的验证
尽管在9小时峰值时细胞内Cu(I)没有统计学显著增加，但随后的BCS螯合实验完全逆转了相同铜暴露诱导的转录组和坏死表型。一方面，较短的暴露时间和环境相关的暴露浓度导致Cu(I)积累相对较低。另一方面，鳃部转化的Cu(I)被转运至其他器官，如肝脏和大脑[33]、[34]。没有
环境意义
分子尺度的毒性预测在生态毒理学和人类健康风险评估中正日益受到重视。一项标志性研究是从多尺度角度将分子尺度的扰动与流行病学特征相结合，从而能够深入阐明化学暴露与疾病发病机制之间内在联系的分子机理。这些机制层面的洞察为政策制定者制定环境监测策略提供了坚实的科学支撑，
CRediT作者贡献声明
Wen-Xiong Wang：撰写—审阅与编辑、监督、资源、项目管理、资金获取、概念构思。Wanying Gui：撰写—初稿、可视化、方法学、调查、形式分析、数据管理、概念构思。
利益冲突声明
作者声明，他们不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争财务利益或个人关系。
致谢
感谢美国加州大学伯克利分校Christopher Chang教授惠赠Cu(Ⅰ)探针CF4，感谢匿名审稿人对此工作的宝贵评论。本研究得到香港研究资助局一般研究基金（11103426）的资助。W.-X. Wang由香港研究资助局为期5年的高级研究奖学金（SRFS2425-1S06）资助。
重要性声明
当前评估铜（Cu）生态毒性的框架往往忽视了早期分子开关
Wanying Gui|Wen-Xiong Wang
