基于一锅法超声辅助亲和素原位功能化还原氧化石墨烯（rGO）的模块化无标记电化学生物传感平台

《Frontiers in Sensors》：Toward a modular label-free electrochemical biosensing platform based on a one-pot avidin functionalization of reduced graphene oxide

　　

研究人员提出一种一锅法、超声辅助且环境友好的策略，用于氧化石墨烯（GO）的同时部分还原和生物功能化，采用L-酪氨酸（L-tyr）和抗坏血酸（AA）作为温和且互补的还原剂。该协同方法可实现sp²碳骨架的可控部分恢复，同时保留生物分子锚定所需的含氧官能团。亲和素（Av）在还原过程中原位引入，省去合成后修饰步骤，同时发挥其在生物素化识别元件固定中的功能作用。所得亲和素功能化还原氧化石墨烯（rGO）通过亲和素-生物素亲和相互作用，为生物素化识别元件的定向固定提供功能性电化学界面。该固定策略旨在促进不同生物传感界面的组装而无需表面再工程化。该平台作为无标记电化学界面实施，并通过电化学阻抗谱（EIS）监测界面组装和生物识别事件。作为概念验证，研究人员使用凝血酶结合适配体作为代表性生物素化识别元件，用于检测人α-凝血酶（α-th），对所述固定策略进行了实验验证。该平台在1.34 × 10^?9 M至2.67 × 10^?6 M范围内呈线性响应（R² = 0.987），检测限为4.4 × 10^?10 M，并在潜在干扰蛋白和富集人血清样本存在下表现出选择性响应。这些结果表明，一种用于制备亲和素功能化rGO的可持续一锅法策略，并建立基于亲和素的电化学生物界面的概念验证。尽管本研究使用单一适配体-靶标对实验验证该方法，但所提出的固定策略可能促进未来开发采用不同生物素化识别元件且无需改变底层换能器的可适配电化学生物传感平台。

研究背景与问题：石墨烯基电化学传感器因高灵敏度、可调表面化学及适合微型化和即时检测而受到关注。还原氧化石墨烯（rGO，经部分还原的氧化石墨烯）可因sp²碳网络部分恢复而提高电荷转移速率，并依靠残留含氧官能团固定生物识别元件。但rGO生物界面通常先经化学或热还原，再进行合成后生物功能化，存在条件苛刻、步骤多、耗时长、界面控制与重现性受限以及可能损害固定生物分子活性等问题；还原与生物功能化多被分开处理，增加制备复杂性。此外，多数石墨烯基生物传感平台面向单一分析物，难以快速适配不同靶标；石墨烯基适配体传感器多依赖多步制备，界面难以重构。基于此，研究人员提出一锅法温和还原与原位亲和素（Av，可与生物素高亲和结合的蛋白）功能化策略，利用Av-生物素模块化固定生物素化识别元件，并以凝血酶结合适配体检测人α-凝血酶（α-th，凝血相关蛋白生物标志物）进行概念验证。

研究总体、结论与意义：研究人员制备了亲和素功能化rGO（f-rGO），构建GCE/f-rGO/BSA/b-TBA界面，其中GCE为玻碳电极，BSA为牛血清白蛋白封闭剂，b-TBA为生物素化凝血酶结合适配体。EIS结果显示该平台可在无标记条件下检测α-th，线性范围1.34 × 10^?9 M至2.67 × 10^?6 M，R² = 0.987，检测限4.4 × 10^?10 M，并具选择性、血清适用性及4 °C下至少9天储存稳定性，AGREE（Analytical GREEnness Evaluation，分析绿色度评价指标）评分为0.75。其意义在于将表面化学与靶标识别解耦，可通过替换生物素化识别元件构建不同传感界面而无需重新设计底层换能器。

关键技术方法（不超过250字）：采用一锅超声辅助（40 kHz、160 W、30 min）温和还原与原位生物功能化；以紫外-可见（UV-Vis）、傅里叶变换红外（FTIR）和扫描电子显微镜（SEM）表征材料；以EIS在三电极体系中监测界面组装与识别，工作电极为GCE，对电极为铂丝，参比电极为Ag/AgCl，采用HQ/BQ氧化还原探针并以Randles型等效电路拟合电荷转移电阻（R_ct）；以AGREE评估绿色度。样本来源：人α-th为商品化人血来源治疗试剂，由National University of Córdoba公共血液衍生物实验室提供，不涉及临床人样本；人血清为商业冻干人血清Standatrol S-E Level 1和Level 2（Wiener Lab）。

研究结果：
3.1 光谱表征：UV-Vis与FTIR表明L-tyr和AA在超声下协同实现GO部分还原和功能化，恢复sp²共轭并保留含氧官能团。
3.1.1 UV-vis分析：GO在约230 nm及300 nm肩峰；rGO-L-tyr在210–230 nm增强且主带红移展宽；加入AA后吸收进一步增强、羰基相关n–π*减弱，说明sp²共轭部分恢复且保留氧官能团。
3.1.2 FTIR分析：GO显示O-H、C=O（1725 cm^?1）、C=C（约1580 cm^?1）及C-O/C-OH（1050–1240 cm^?1）；rGO-L-tyr出现N-H和-CH₂-相关特征；rGO-L-tyr-AA的1725 cm^?1减弱、1560–1640 cm^?1的C=C增强，表明L-tyr主要参与基面修饰和聚合辅助还原，AA促进边缘含氧基团去除。
3.2 形貌表征：SEM显示GO为薄纸状褶皱片层；rGO-L-tyr-AA更紧凑、互联且片层增厚；f-rGO保持层状结构但表面异质性增加，支持生物分子掺入且未导致结构崩塌或过度聚集。
3.3 电化学表征：EIS监测界面组装，R_ct变化用于评估还原、生物功能化和识别事件。
3.3.1 GO还原优化：L-tyr浓度0–4 mg mL^?1时R_ct无显著变化，选0.50 mg mL^?1；超声30 min兼顾分散稳定与电化学响应，60 min因过度剥离使R_ct升高；AA 0.25与0.50 mg mL^?1无显著差异，选0.25 mg mL^?1；双还原剂30 min为最佳。
3.3.2 一锅生物功能化与生物界面组装优化：GCE/rGO至GCE/f-rGO的R_ct增加，支持Av掺入；BSA封闭和b-TBA固定进一步增加R_ct，支持Av-生物素结合能力保留；BSA 30 min有效，先封闭后固定b-TBA更优；Av选1.00 mg mL^?1以获得更高绝对电化学响应。
3.3.3 b-TBA固定时间影响：30 min已增加R_ct，60 min显著更高且α-th响应更大，故选60 min；无适配体时直接暴露α-th未见显著R_ct变化，说明非特异性作用可忽略。
3.4 分析性能：EIS显示R_ct随α-th浓度系统增加，–log[α-th]在1.34 × 10^?9 M至2.67 × 10^?6 M呈线性（R² = 0.987）；按IUPAC实验确定LOQ，并由ICH/IUPAC关系估算LOD为4.4 × 10^?10 M；10 μL体系LOQ对应13.4 fmol，实现无标记、无信号放大的定量检测。
3.5 选择性：与Cyt C、Myo、Lys、人血清及血清加干扰物比较，α-th引起明显响应；氨基酸、电活性分子、无机盐、Level 2血清及混合物干扰可忽略；加标回收率96%–104%，RSD在电化学分析预期范围。
3.6 稳定性：4 °C储存9天内R_ct稳定；室温信号变异逐渐增加；超过9天阻抗响应偏离，14天保留约70%初始分析信号，提示可支持批次制备和短期储存。
3.7 可持续性评估：AGREE评分0.75，归因于低毒还原剂、低试剂消耗、短超声处理及一锅集成；半自动流程仍需人工，全生命周期和能耗定量未纳入。

讨论与结论翻译：讨论部分指出，部分已报道石墨烯基凝血酶适配体传感器虽具更低LOD，但多依赖多步制备、苛刻化学还原、标记检测或复杂夹心/纳米复合结构；本研究将温和绿色还原与原位生物功能化整合为一锅流程，并保持灵敏度、选择性和简化制备，动态范围覆盖nM至μM，与止血、血栓性疾病、神经退行性疾病、动脉粥样硬化和癌症相关过程监测相关。结论翻译：本研究开发并系统评估了一种用于GO加工的一锅法策略，作为制备生物功能化石墨烯基界面的通用途径。该方法能够生成部分还原、生物功能化的石墨烯平台，将受控表面化学与有利电化学性能结合，为电化学生物传感应用提供简化和可持续的替代方案。多模式光谱和形貌表征表明，温和互补还原剂在超声辅助条件下的协同作用可实现sp²碳骨架的可控部分恢复，同时保留高效生物分子锚定所需的含氧表面官能团。电子导电性与表面化学之间的平衡形成具有合适电化学性能的稳健界面。EIS分析显示，在生物功能化和靶标识别过程中，界面性质逐步且可重复演变，突出该平台在无标记配置下支持选择性分子相互作用的能力。在蛋白富集人血清样本中获得的传感性能进一步说明所提出界面设计的稳健性和分析适用性。AGREE评估强调该方法的良好绿色特征，反映低毒试剂、温和处理、简化流程和低试剂消耗。总之，这些结果验证了所提出的集成方法，表明受控部分还原与同时形成生物界面结合，是工程化稳定且具有电化学活性的石墨烯基生物电化学界面的有效策略。值得注意的是，冷藏条件下9天储存稳定性与一锅法方案相结合，突显该平台用于批次制备和简化制造流程的潜力。进一步研究应关注生物功能层的长期完整性，包括蛋白变性或生物分子脱附的可能影响及其对延长储存期间传感器可靠性的影响。尽管在所用实验条件下获得可重复结果，未来研究应进一步考察工艺标准化以及与部分还原过程相关的潜在批间差异。除本文展示的特定凝血酶适配体传感应用外，所提出生物界面工程策略的模块化特性为开发靶向广泛生物分子分析物的下一代石墨烯基电化学生物传感器和集成分析平台提供通用基础。此外，亲和素介导的生物功能化方法的多样性可能促进未来整合到便携式、微流控和即时检测传感平台中。