《Frontiers in Arachnid Science》：Exploring the microbiome of Otobius megnini in Mexico
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引言：蜱类携带复杂微生物群落，这些群落影响蜱的生物学特性及其病原传播能力。尽管硬蜱微生物群已被广泛研究，但软蜱如Otobius megnini的微生物群仍相对研究不足。方法：在本探索性研究中，研究人员比较了两个独立生成的Otobius megnini 16S
引言：蜱类携带复杂微生物群落，这些群落影响蜱的生物学特性及其病原传播能力。尽管硬蜱微生物群已被广泛研究，但软蜱如Otobius megnini的微生物群仍相对研究不足。方法：在本探索性研究中，研究人员比较了两个独立生成的Otobius megnini 16S rRNA数据集，样本分别采集自Querétaro和Comarca Lagunera，并使用PICRUSt2（Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States 2）生成预测的MetaCyc通路谱。研究人员对分类组成、α多样性和β多样性、探索性共现网络拓扑及预测功能谱进行描述性比较。组织类型、16S区域、宿主重复、生活阶段、吸血状态和实验室处理方面的差异阻碍了将观察结果因果归因于地理。结果：两个数据集均显示反复出现的细菌类群，包括Staphylococcus、Corynebacterium和Coxiella-like organisms。Comarca Lagunera的Pielou均匀度高于Querétaro，观察到的特征丰富度低于Querétaro（Kruskal–Wallis：两者p = 0.0001），而Shannon多样性无差异（p = 0.888）。Bray–Curtis置换多元方差分析（PERMANOVA，permutational multivariate analysis of variance）显著（p = 0.0001），但多变量离散度也显著不同（betadisper方差分析（ANOVA，analysis of variance）：F = 10.61，p = 0.0001）。因此，PERMANOVA结果不能解释为组质心的明确差异。推断网络在拓扑上存在描述性差异，PICRUSt2预测了跨数据集共享的通路，包括与中心碳代谢、氨基酸生物合成和辅因子代谢相关的通路。结论：这些结果为两个独立生成的Otobius megnini微生物组数据集提供了描述性基线。由于数据集身份与组织类型、16S区域、宿主重复、生活阶段、吸血状态和实验室处理混杂，观察到的差异不能归因于地理。网络和PICRUSt2结果具有假设生成性，不能确立微生物组稳定性、稳健性、功能保守性、冗余性或代谢活性。
研究背景与问题：蜱类携带复杂且动态的微生物群落，可影响蜱的发育、营养、免疫稳态和媒介能力。越来越多证据表明，蜱相关微生物群并非被动集合，而是结构化、功能相互关联的群落，可调节病原定殖、持续和传播。Otobius megnini俗称刺耳蜱，为单宿主Argasidae软蜱，广泛分布于美洲干旱和半干旱地区，包括墨西哥、美国西南部及中南美洲部分地区；主要寄生于牲畜，尤其牛，也见于马、羊、山羊、野生动物，偶见人。与多数Ixodidae硬蜱不同，O. megnini仅幼虫和若虫阶段寄生，并在宿主外耳道内长期停留、反复吸血，占据稳定而高度特化的微环境；该限制性生态位可能塑造其微生物群落。O. megnini侵染可致耳炎、炎症、组织损伤、继发细菌感染，严重时因耳道刺激出现神经表现，并造成动物福利下降、生产力降低和畜牧经济损失。问题在于其微生物群长期被忽视，蜱微生物组研究多集中于Ixodes、Rhipicephalus和Amblyomma等硬蜱，Argasidae软蜱研究相对不足。研究人员因此开展探索性数据集层面比较，而非地理效应检验，以描述两个独立O. megnini 16S rRNA数据集的微生物多样性、共现网络拓扑和PICRUSt2预测MetaCyc通路谱，为后续标准化研究提供描述性基线。
关键技术与方法（不超过250字）：研究人员整合两个独立16S rRNA基因扩增子数据集：Comarca Lagunera公共数据集12个样本，来源于蜱内脏（中肠及相关内部组织），采用Illumina 16S rRNA V3–V4扩增子测序，NCBI BioProject PRJNA1022463；Querétaro数据集为本研究新生成，11个符合测序质量标准的完全饱血若虫样本，采自单一牛宿主外耳道，代表单次宿主相关侵染事件的子样本，靶向V4区，NCBI BioProject PRJNA1420609。两数据集经QIIME 2（v2024.10）统一流程处理，DADA2（扩增子序列变体（ASV，amplicon sequence variant）推断）去噪、去嵌合体，SILVA 138分类；计算α多样性、Bray–Curtis和Jaccard距离、PERMANOVA及betadisper；以SparCC（sparse correlations for compositional data）构建共现网络并用NetCoMi比较，NetSwan生成描述性节点移除曲线；PICRUSt2预测MetaCyc通路，ALDEx2分析差异通路。
研究结果：
3.1 序列分析：Querétaro样本平均95.6%输入reads通过质量过滤、去噪和去嵌合体；阴性提取和PCR对照无扩增，但未测序，无法进行正式序列污染鉴定；最终非嵌合reads为40,635–62,384。Comarca Lagunera去噪效率变异较大，非嵌合read保留率58.3%–98.1%，多数样本保留高测序深度，最大read数80,173。合并后read数1,112–62,362，共获得1,067个ASV；两个Comarca Lagunera样本因低于8,000 reads被排除于稀释α多样性及Bray–Curtis排序、PERMANOVA和betadisper分析；α稀释曲线早期达到平台，提示保留样本测序深度足以捕获观察分类丰富度。
3.2 O. megnini微生物群多样性与组成：Comarca Lagunera的Pielou均匀度显著高于Querétaro（Kruskal–Wallis p = 0.0001），观察特征丰富度显著低于Querétaro（p = 0.0001），Shannon多样性无显著差异（p = 0.888）。Bray–Curtis PERMANOVA检测到数据集差异（p = 0.0001），但多变量离散度亦显著不同（betadisper ANOVA：F = 10.61，p = 0.0001），故不能仅解释为组质心差异。Jaccard距离层次聚类在过滤非稀释数据上描述性纳入全部23个样本。分类比较显示10个共有类群，包括Coxiella-like organisms、Staphylococcus、Candidatus Endoecteinascidia和Corynebacterium；Querétaro独有109个类群，包括Enterobacteriaceae、Escherichia–Shigella和Bacillus，Comarca Lagunera独有5个类群，主要属于Corynebacteriales和Actinobacteria。Coxiella-like organisms在Querétaro 6/11、Comarca Lagunera 3/12样本中检出。ANCOM-BC分析显示Querétaro相对Comarca Lagunera主要富集Acinetobacter、Escherichia–Shigella、Cutibacterium、Pseudomonas、Staphylococcus和Streptococcus，而Candidatus Endoecteinascidia在Querétaro相对耗竭。结论为两数据集存在反复类群，但组成、丰富度和均匀度不同，且受混杂限制。
3.3 探索性微生物共现网络推断拓扑在数据集间不同：研究人员分别构建Querétaro和Comarca Lagunera属水平共现网络；在|r| ≥ 0.75时，Querétaro网络18个节点、26条边且全为正关联，Comarca Lagunera网络11个节点、23条边且全为负关联；Querétaro模块度0.41、3个社区，Comarca Lagunera模块度?0.12、11个社区。阈值降至|r| ≥ 0.50时，Querétaro网络扩展至78个节点、138条边，Comarca Lagunera仍为11个节点、23条边，显示阈值敏感性。NetCoMi的Jaccard中心性比较未检测到显著差异；核心关联网络分析未发现满足核心流行阈值0.8及零模型比较的重复关联。节点移除曲线仅作描述性展示，因网络未大小匹配且节点数和密度不同，不能推断稳健性、稳定性或恢复力差异。
3.4 两个数据集的预测功能通路谱：PICRUSt2分析23个样本，丰度加权NSTI（nearest sequenced taxon index）均值0.2065 ± 0.1780，中位数0.1130，范围0.0175–0.7393；14/23（60.9%）样本NSTI<0.15，其中Comarca Lagunera 9/12（75.0%）、Querétaro 5/11（45.5%）。预测238条通路为两数据集共享，178条仅见于Querétaro，无仅见于Comarca Lagunera者。共享通路主要涉及中心碳代谢，包括糖酵解、三羧酸（TCA，tricarboxylic acid）循环、磷酸戊糖途径、发酵途径和乙醛酸旁路；通路计数为描述性，可能部分反映Querétaro较高分类丰富度。ALDEx2识别的前25条差异预测通路（q < 0.05）层次聚类显示两数据集通路表示不同；多数在Querétaro富集，包括碳水化合物和糖醛酸降解通路（GALACTUROCAT.PWY、GALACT.GLUCUROCAT.PWY）、多胺生物合成（POLYAMSYN.PWY）和精氨酸生物合成（ARG...SYN）；Comarca Lagunera强富集于支链氨基酸（BCAA，branched-chain amino acid）生物合成通路，包括异亮氨酸（ILEUSYN.PWY）、缬氨酸（VALSYN.PWY）和一般BCAA合成（BRANCHED.CHAIN.AA.SYN.PWY）。较高功能层级上，辅因子、载体和维生素生物合成在两数据集中均最突出，其次为前体代谢物和能量生成、芳香化合物降解、碳水化合物降解和氨基酸生物合成。上述结果为预测功能潜力，并非代谢活性证据。
讨论总结：讨论指出，O. megnini作为具有兽医重要性的软蜱，其微生物组研究仍不足；两个独立数据集不仅显示细菌丰富度和群落组成差异，也共享Staphylococcus、Corynebacterium、Coxiella-like organisms和Candidatus Endoecteinascidia等反复类群，但其相对贡献变化，且反复出现不应解释为稳定分类核心。由于缺乏测序阴性对照，公共数据集亦无可比对照，Staphylococcus和Corynebacterium中皮肤或试剂相关污染的贡献无法解析。与Molina-Garza et al.关于墨西哥北部白尾鹿蜱类的研究相呼应，O. megnini细菌多样性最低并强受Candidatus Endoecteinascidia主导；本研究中该菌亦被检出且Comarca Lagunera相对丰度高于Querétaro，但不足以证明物种范围主导或内共生体稳定性。Coxiella-like organisms符合Argasidae生物学背景，在多种软蜱中广泛分布且种间变异明显；本研究支持其在O. megnini中出现，但不支持均匀主导关联。多样性模式中，Comarca Lagunera低观察丰富度但高均匀度、Shannon无差异，提示差异主要由检出类群数量及分布驱动，而非整体多样性一致变化；PERMANOVA显著伴随离散度差异，限制其解释。共现网络拓扑差异受样本量、分类组成、相关阈值和流行率结构影响，中心性无显著差异仅表示未检测到差异，不等于等价或保守。功能预测中，共享中心碳代谢、氨基酸和核苷酸生物合成、辅因子和维生素代谢等通路；Querétaro预测通路更多，可能与其较高分类丰富度、组织类型（中肠 vs 内脏）和生理状态有关，不能解释为区域特异代谢能力；NSTI仅反映系统发育接近性，不验证通路活性。限制包括16S区域不同（V4 vs V3–V4）、实验室流程不同、组织制备不同、Comarca Lagunera生活阶段和吸血状态缺失、Querétaro全部蜱来自单一牛宿主和单次侵染事件、阴性对照未测序、解剖前过夜孵育可能改变相对细菌丰度、网络样本量小且无大小匹配零模型或子采样分析、PICRUSt2为基于参考基因组接近性的预测而非基因含量或代谢活性测量。因此，观察差异不能归因于地理，可能反映技术和生物学混杂，需在匹配组织、重复宿主、匹配测序区域和测序阴性对照的标准化数据集中验证。
研究结论翻译：本探索性研究比较了墨西哥O. megnini两个独立生成的16S rRNA数据集。两个数据集均检出反复出现的属，但分类组成、多样性指标、推断网络拓扑和预测通路谱存在差异。由于数据集身份与组织类型、16S区域、宿主重复、生活阶段、吸血状态和实验室处理完全混杂，这些差异不能归因于地理。网络和PICRUSt2结果具有假设生成性，不能确立微生物组稳定性、稳健性、功能保守性、冗余性或代谢活性。需要采用匹配组织、重复宿主、匹配测序区域和测序阴性对照的标准化研究，以检验这些观察的可重复性和生物学意义。
