稻虾综合种养结合秸秆还田下碳氮循环功能的元基因组洞察

《Frontiers in Microbiology》：Metagenomic insights into carbon and nitrogen cycling functions in an integrated rice-crayfish farming system with straw return

　　

秸秆还田是农业残留物利用的重要策略，功能性微生物群落已知在秸秆分解和养分循环中发挥关键作用。然而，稻渔系统中秸秆分解动态及相关微生物功能结果仍缺乏记录。该研究建立了稻虾综合种养结合秸秆还田系统，并通过土壤理化性质表征、酶活性测定和元基因组测序评估秸秆分解机制及其对土壤肥力的改善。土壤样品于7月（PF7，克氏原螯虾养殖期后水稻移栽阶段）和11月（PF11，收获后晒田期）采集，以周围沟渠为对照（CK7和CK11）。结果表明，秸秆被有效分解，释放钾和氮养分，同时稻田脲酶和纤维素酶活性显著升高。元基因组分析显示，Pseudomonadota为优势门，而Euryarchaeota和Nitrososphaerota变化最显著，其在PF11中的丰度分别为CK11的0.23倍和10.57倍。在碳（C）循环中，C降解是最丰富的通路，其中氨基酸降解（主要来源于克氏原螯虾养殖）占主导，其次为芳香族化合物降解（与秸秆分解相关）。对于甲烷代谢通路，温室气体排放潜力降低，表现为PF中mcrA丰度低于CK。氮（N）循环主要由有机氮代谢介导（81.63–84.14%），其余部分以硝化和反硝化为主。此外，相关分析一致表明，C循环基因占据更中心位置，总氮（TN）对这些基因显示负效应。总体而言，该综合系统与秸秆分解相关，促进末端有机C和N矿化，同时温室气体相关功能潜力降低，支持稻虾农业生态系统中秸秆可持续利用。

一、研究背景、问题与意义
中国每年产生大量水稻秸秆，直接焚烧虽可抑制病虫害并以灰分形式返还少量养分，但会移除大部分秸秆源养分和土壤微生物并造成严重空气污染，因此已被禁止。秸秆主要由木质素、纤维素和半纤维素组成，分解不足可能影响作物健康与产量稳定性；直接还田还可能引入病原和虫卵，并增加温室气体排放潜力。已有深埋、堆腐还田、分解剂、腐殖酸和微生物菌群等策略，秸秆与有机肥配施因维持土壤多功能性而受到关注。稻渔综合种养在中国快速发展，2024年全国面积约307万公顷，其中稻虾综合种养约占56.46%，克氏原螯虾（Procambarus clarkii）为主要养殖种；残饵和粪便构成重要有机肥输入，稻田作为间歇湿地为微生物提供生境。碳（C）和氮（N）是农业生态系统基础养分，微生物参与的C、N循环过程对可持续农业发展至关重要。已有大量秸秆分解和微生物群落演替研究，但在稻渔综合系统中秸秆直接还田能否有效分解、能否提升稻田土壤肥力仍缺乏探讨。研究人员建立稻虾综合种养结合秸秆还田系统，提出假设：克氏原螯虾养殖活动促进秸秆分解，至PF7秸秆分解进入后期，易降解组分几乎完全分解，难降解有机组分在水稻生长季缓慢分解；PF11晒田进一步促进秸秆分解并降低温室气体排放潜力。研究通过土壤理化性质、酶活性和元基因组测序系统考察土壤肥力、酶活性和微生物功能谱变化，目标是评估该模式下土壤肥力演变和秸秆分解潜力，阐明C、N循环微生物机制，并评价促进秸秆分解、维持土壤肥力和降低温室气体排放潜力的生态效益，为稻渔系统中秸秆分解过程及秸秆资源高效利用提供理论基础。

二、主要关键技术方法
采集肥西龙冠河生态农业有限公司（117.34°E，31.58°N）稻虾综合种养田稻田（PF）及周围沟渠（CK）0–20 cm土壤，2025年7月和11月五点S形采样，微生物分析样品?80 °C保存，理化分析样品风干。测定pH、有效钾（AK）、总氮（TN）、土壤有机质（SOM）、铵态氮（NH₄⁺-N）、碱解氮和硝态氮（NO₃^?-N）及蛋白酶、脲酶、纤维素酶、蔗糖酶活性；元基因组测序于DNBSEQ-T7平台完成，经fastp质控、MEGAHIT组装、Prodigal预测开放阅读框（ORF）、CD-HIT构建非冗余基因集、bowtie2比对、Diamond注释NR和KEGG、hmmscan注释碳水化合物活性酶（CAZyme），并开展冗余分析（RDA）、偏最小二乘路径模型（PLS-PM）、Mantel检验和网络分析。

三、研究结果
3.1 土壤理化性质与酶活性：通过理化测定和酶活测定发现，PF7所有肥力指标（K、N、C）均高于CK7，表明秸秆分解释放N、K并促进SOM积累；PF11的N、K低于PF7，SOM略增。7月PF7脲酶和纤维素酶活性较CK7分别提高34%和143%，蛋白酶和蔗糖酶相近；11月PF11四种酶均高于CK11，但较PF7蛋白酶、脲酶和蔗糖酶下降，纤维素酶相近。
3.2 微生物多样性与丰度：通过元基因组测序发现，Pseudomonadota为最丰富门（21.91%–32.02%）；PF7中Bacteroidota为CK7的0.35倍，Nitrososphaerota和Gemmatimonadota分别为CK7的7.60和2.74倍，PF11中二者分别为CK11的10.57和4.46倍；PF11中Euryarchaeota和Thermodesulfobacteriota降至CK11的0.23和0.35倍；Cyanobacteriota在PF7高于CK7，PF11仅为PF7的5.7%。主坐标分析（PCoA）第一、第二轴分别解释47.28%和13.48%，PF与CK分离。
3.3 C循环与关键功能基因：通过KEGG level 3注释发现，C降解占C循环的78.37%–79.92%，其中氨基酸降解占37.71%–39.73%并占主导，归因于克氏原螯虾养殖有机输入；芳香族化合物降解居第二且PF高于CK，与秸秆分解相关；脂肪酸和甾醇降解在PF富集，果胶和糖醛酸降解下降；GST、paaH、amiE和clcD较高，katG和ramA降低；CAZyme中糖苷水解酶（GHs）和糖基转移酶（GTs）分别占44.32–53.03%和37.88–46.19%，GH5、GH31、GH29下降，GH94在PF11最高；甲烷代谢中乙酸营养型产甲烷主导（PF7为43.67%，PF11为46.74%），mcrA在PF低于CK，pmoA在PF高于CK，PF11产甲烷相关基因下降，提示净甲烷排放潜力降低。
3.4 N循环与关键功能基因：通过N循环功能基因分析发现，有机N代谢占81.63–84.14%，其余以硝化、反硝化、固氮、异化硝酸盐还原为铵（DNRA）和同化硝酸盐还原为铵（ANRA）为主；PF中有机N代谢、固氮和DNRA较低，ANRA、硝化和反硝化较高；glnA、gltB/gltD、gdhA、ureC、nifH/nifD/nifK、nrfA/nrfH和nirB较低，nxrA、nasA/nasB和nirA较高；反硝化中narG在PF11高于CK11，norB在PF较低且PF11最低，nirK升高而nirS降低，nosZ在PF11高于CK11，低norB和高nosZ指示N₂O排放潜力降低。
3.5 土壤性质、酶活性、微生物群落与C、N循环基因关系：通过RDA、网络分析、Mantel检验和PLS-PM发现，RDA前两轴解释61.60%和10.70%，累计72.30%，置换检验不显著（p=0.2123）；土壤水分（SM）与Bacteroidota、Thermodesulfobacteriota、Myxococcota和Cyanobacteriota呈正关联，碱解氮与Nitrospirota和Nitrososphaerota关联最强，SOM与Chloroflexota、Euryarchaeota、Pseudomonadota和Myxococcota正相关，SOM与Euryarchaeota正线性最强，TN与该古菌门负线性；网络含67节点、411边，平均度12.27，图密度0.186，聚类系数0.452，度中心性前15中10个为C循环基因、5个为N循环基因，57.96%的C、N循环基因呈正共现；纤维素酶与C、N循环基因强相关，脲酶亦正相关；PLS-PM中TN与N循环酶正趋势（路径系数0.73），与C循环基因负趋势（?1.00），多数假设直接路径不显著。

四、讨论部分总结与结论翻译
讨论部分总结：4.1理化性质与酶活性方面，稻虾综合系统整合克氏原螯虾和水稻生长期，沟渠富含有机质沉积物转移至稻田是重要差异来源；秸秆K释放快，7月PF7的AK较高，11月PF11因水稻吸收而降低，N亦被持续消耗，SOM因秸秆残余和有机物料逐步分解而保持稳定；中国稻田SOM和TN平均分别为21.23 g/kg和1.98 g/kg，PF的SOM接近或略高，TN低于平均。酶活呈底物特异性演替，PF7蛋白酶和蔗糖酶与CK7相近而纤维素酶和脲酶较高，表明易降解可溶性糖和蛋白类基本消耗、纤维素降解进入峰值、秸秆分解至中后期；沟渠沉积物转移降低CK11有机质并导致酶活较低；除纤维素酶外其他酶下降，说明纤维素持续强烈水解。4.2微生物多样性方面，Pseudomonadota占比最大并参与C循环，RDA显示其与SOM正相关；Euryarchaeota变化最显著，主要为产甲烷古菌，是区分PF与CK的核心类群；其与SOM正相关、与多种N组分负相关，PF7中虽SOM较高但Euryarchaeota仅为CK7的0.80倍，因秸秆分解早期N释放快于有机质分解、提高N有效性而抑制产甲烷菌；PF11降至CK11的0.23倍，受土壤通气增强、氮竞争、水分降低及沟渠有机质转移扩大氮差距共同驱动。4.3 C/N循环方面，有机肥配施秸秆可促进分解，本系统克氏原螯虾养殖期持续淹水，7月分解至后期，11月达最终腐解；有机碳降解以脂肪酸、芳香环和氨基酸为主，纤维素和半纤维素未作为主要降解途径检出，脂肪酸和氨基酸降解可能与克氏原螯虾养殖有机质有关，芳香环降解为木质纤维素后期特征；GH94在PF11较高，表明秸秆降解达最终阶段，稻田干湿交替促进分解。CH₄循环中，Euryarchaeota在PF11仅为CK11的0.23倍，mcrA较低而pmoA较高，表明产甲烷受抑制、甲烷氧化增强，降低甲烷排放潜力；产甲烷优先利用乙酸，70%–80%甲烷来自乙酸转化，PF11产甲烷抑制部分与乙酸底物可用性降低有关。有机氮降解主导N循环（81.63–84.14%），与有机碳降解耦合，主要涉及氨基苯甲酸、硝基甲苯、支链氨基酸（缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸）和赖氨酸分解，反映植物源木质素类和动物源蛋白类有机氮池的活跃矿化；C、N库均进入矿化后期，易降解底物耗尽，微生物转向难降解芳香含氮化合物和支链氨基酸。秸秆还田可增强N₂O排放，稻田好氧-厌氧交替增强硝化-反硝化气态N损失；本研究中固氮较低，amoA和hao低提示氨氧化受限，nxrA/nxrB较高提示亚硝酸盐氧化潜力仍存；反硝化中narG高、norB低、nosZ高指示N₂O排放潜力降低；PF7硝化和反硝化高于CK7，PF11反硝化低于PF7，主要与晒田降低SM、增加氧可用性而抑制反硝化有关。4.4建议方面，因TN低于全国平均且水稻生长后期明显下降，建议以缓释氮肥替代常规复合肥；沟渠环境 mitigations 可采用放养滤食性鱼如鲢和鳙（Hypophthalmichthys molitrix、Hypophthalmichthys nobilis）或采用无沟稻虾系统。4.5局限性方面，单田单沟且五个空间子样本为伪重复，PF与CK比较仅为观测趋势，不能支持正式统计显著性检验；仅两个时间点限制连续分解动态认识；单点限制普适性；未来应设无秸秆还田稻虾系统和水稻单作对照及独立田间重复；PLS-PM路径系数尤其TN到C循环基因的?1.00边界值应视为探索性而非验证性。
结论部分翻译：该研究评估了稻虾综合种养结合秸秆还田对土壤理化性质、酶活性及C、N循环相关微生物功能基因的影响。主要结论如下：（1）克氏原螯虾养殖期后，稻田PF7的SOM和TN高于周围沟渠CK7，脲酶和纤维素酶活性增强，表明秸秆分解进入有效阶段且土壤肥力显著改善；水稻生长季末PF11的SOM相对稳定而TN下降，表明氮被水稻持续吸收，有机质则通过秸秆残余和有机物料逐步分解而持续积累。（2）元基因组分析表明，至克氏原螯虾养殖期末PF7秸秆分解已进入后期，至水稻生长季末PF11已达最终阶段；该综合系统具有显著的温室气体减排功能潜力。（3）在该稻虾综合种养结合秸秆还田系统中，土壤理化性质和酶活性与功能基因谱关联较弱，例外是TN对C循环基因具有强负直接效应，提示氮有效性而非总体肥力指标约束群落功能潜力；该发现揭示稻虾综合系统中微生物群落调控机制的复杂性，并为未来识别该系统微生物群落动态的真正生态驱动因子提供方向。