物种特异性dsRNA：EGFP衍生小RNA图谱揭示昆虫中计算siRNA预测的偏差——对新siRNA选择策略的启示

《Journal of Insect Physiology》：Species-specific ds EGFP-derived small RNA profiles reveal divergence from computational siRNA predictions in insects: Implications for a new siRNA selection strategy

　　

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  用dsEGFP孵育组织产生了物种特异性的小RNA谱。
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  P. xylostella的正义链siRNA丰度低于T. castaneum。
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  正义链siRNA沿dsEGFP序列形成共享和物种特异性的热点。
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  丰富的19–25-nt正义链siRNA显示出物种特异性的5′端组成。
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  预测的siRNA与实验鉴定的21-nt siRNA不完全匹配。

引言

RNA干扰（RNAi）是一种保守的基因调控机制，广泛用作功能基因组学工具，也是昆虫害虫防治的一种有前景的策略（Baum and Roberts, 2014; Duanmu等, 2025; Ortolá和Daròs, 2024）。在昆虫中，双链RNA（dsRNA）可被Dicer酶加工成小干扰RNA（siRNA），通常在21–22 nt范围内，尽管dsRNA衍生小RNA的大小分布因物种而异（Santos等, 2019）。siRNA双链体装载到RNA诱导沉默复合物（RISC）后，正义链（也称乘客链）被移除，而正义链（也称引导链）被保留。正义链随后指导对互补靶mRNA的序列特异性识别（Meister和Tuschl, 2004; Zhu和Palli, 2020）。由于这种序列特异性的作用方式，基于RNAi的方法为选择性地沉默必需害虫基因提供了一种有前景的策略，从而提供了靶向害虫管理的潜力，同时减少了对传统化学杀虫剂的依赖（He等, 2022; Liu和Smagghe, 2026）。

尽管其前景广阔，但RNAi效率在昆虫类群中差异巨大（Joga等, 2016; Wang等, 2016; Willow和Veromann, 2021）。鞘翅目昆虫，包括赤拟谷盗（Tribolium castaneum）和几种叶甲科甲虫，通常对外源施加的dsRNA高度响应，尤其是通过注射递送的方式（Kaplanoglu等, 2026; Knorr等, 2018）。相比之下，许多鳞翅目物种表现出可变或有限的RNAi响应，无论dsRNA是通过注射还是口服递送（Guan等, 2025; Ortolá和Daròs, 2024; Terenius等, 2011）。已提出多种因素可能促成这些差异，包括核酸酶对dsRNA的降解（Guan等, 2018b; Wang等, 2016）、细胞摄取差异（Saleh等, 2006; Shukla等, 2016）、内体捕获（Yoon等, 2017）、有限的全系统RNAi（Joga等, 2016; Scott等, 2013）、RNAi核心机制差异（Koo和Palli, 2025; Singh等, 2017），以及小RNA加工的差异（Santos等, 2019; Singh等, 2017）。然而，尽管提出了许多潜在的瓶颈，驱动RNAi效率物种特异性差异的机制仍未完全阐明（Cooper等, 2019; Koo和Palli, 2025; Zhu和Palli, 2020）。特别是，鞘翅目和鳞翅目昆虫之间RNAi效率的差异是否与RNAi机制对dsRNA衍生siRNA的加工差异相关，仍然不清楚。

近期改善RNAi性能的努力包括通过各种纳米颗粒系统增强dsRNA稳定性和递送的策略（Quilez-Molina等, 2024; Yan等, 2021）。与此同时，RNAi策略正从长dsRNA扩展至基于siRNA或结构化RNA的方法，包括旨在提高稳定性、递送和基因沉默效率的自组装RNA纳米结构（Pang等, 2026; Xia等, 2025）。这些方法提出了一个重要问题：应选择和构建哪些siRNA用于递送？传统上，siRNA候选物是通过计算设计算法选择的，这些算法考虑经验序列规则、热力学不对称性、靶标可及性和潜在的脱靶效应（Ding等, 2004; Henschel等, 2004; Khvorova等, 2003; Reynolds等, 2004）。然而，计算预测的siRNA可能不一定反映在不同昆虫物种中产生siRNA群体时的Dicer切割偏好（Fan等, 2022; Guan等, 2018a）。因此，表征特定昆虫物种的内源小RNA群体对于确定计算预测的siRNA是否反映体内产生的生物富集siRNA以及指导物种特异性siRNA选择以提高RNAi效率至关重要。

在本研究中，我们调查了靶向增强绿色荧光蛋白基因的同一无特异性外源dsRNA（dsEGFP）是否在赤拟谷盗（Tribolium castaneum）和菜蛾（Plutella xylostella）中产生不同的小RNA谱。这两个物种表现出对比鲜明的RNAi效率，前者高度响应而后者高度抗RNAi。dsEGFP与每个物种的组织孵育后，从孵育组织中提取小RNA并进行测序。我们随后表征了映射到dsEGFP的小RNA群体，并检查了其大小分布、正义链和正义链偏向、链特异性覆盖模式、归一化正义链热点重叠以及5′读取末端核苷酸组成。我们进一步将最丰富的21-nt dsEGFP衍生正义链siRNA与DSIR和siDirect计算预测的siRNA候选物（Naito等, 2009; Vert等, 2006）进行了比较，以评估基于预测的siRNA设计与实验鉴定的siRNA之间的对应关系。本研究的结果有助于解释RNAi效率的物种特异性差异，并加深我们对计算预测的siRNA候选物与实验鉴定的siRNA之间关系的理解，从而指导合理的siRNA设计以提高RNAi效率。

章节片段

昆虫

赤拟谷盗（Tribolium castaneum，GA-1菌株）和菜蛾（Plutella xylostella）的种群在堪萨斯州立大学（曼哈顿，堪萨斯州）的实验室条件下维持。T. castaneum在30 °C下饲养，饮食由95%有机未漂白小麦粉（Great River Organic Milling, Fountain City, WI, USA）和5%啤酒酵母（Earthborn Elements, InPivota Corp., American Fork, UT, USA）组成，而P. xylostella在28 °C下用人工饲料饲养

dsEGFP孵育后P. xylostella和T. castaneum的小RNA测序概述

小RNA测序在P. xylostella中每样品产生了1080万至1280万条总小RNA读取，在T. castaneum中每样品产生了1130万至1320万条读取（表1）。在这些读取中，19–25 nt的小RNA在P. xylostella中占330万至590万条读取，在T. castaneum中占380万至590万条读取，分别占总小RNA读取的30.8–45.6%和33.6–44.8%。映射到dsEGFP参考序列在两个物种中均鉴定出dsEGFP衍生小RNA（表2）。为了评估

讨论

RNAi效率在昆虫类群中差异显著，但驱动这种变异的机制仍知之甚少（Cooper等, 2019）。在本研究中，我们比较了T. castaneum和P. xylostella中dsEGFP衍生小RNA谱，以确定具有不同RNAi效率的昆虫物种在从相同dsRNA产生和富集siRNA方面是否存在差异。我们的结果显示，这两个物种之间dsEGFP衍生小RNA谱在大小方面存在差异

CRediT作者贡献声明

Junepyo Oh：撰写-审阅与编辑，撰写-初稿，可视化，验证，方法学，调查研究，形式化分析，数据整理，构思。Kun Yan Zhu：撰写-审阅与编辑，监督，资源，项目管理，方法学，调查研究，经费获取，构思。

利益冲突声明

作者声明他们不存在可能影响本论文报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢

作者感谢Zhu实验室（堪萨斯州立大学）所有实验室同事提供的卓越技术协助。本研究由美国农业部（USDA/NIFA 2023-67013-39166）资助。本手稿是堪萨斯州曼哈顿堪萨斯州立大学堪萨斯农业实验站第27-025-J号贡献。

Junepyo Oh|Kun Yan Zhu