细菌界面与表面化学调控微生物诱导磷酸钙沉淀中羟基磷灰石矿物架构的微观机制

《Frontiers in Microbiology》：Bacterial interfaces and surface chemistry shape hydroxyapatite mineral architecture during microbially induced calcium phosphate precipitation

　　

磷酸钙（calcium phosphate）生物矿化在地质沉积物形成、生物材料构建及环境修复中具有关键作用。尽管已知微生物可影响磷酸钙沉淀，但细菌细胞表面与胞外聚合物（extracellular polymeric substances, EPS）的相对贡献仍不明确。该研究首次在微观尺度上比较革兰阳性（Gram-positive, G⁺）和革兰阴性（Gram-negative, G^?）细菌细胞及EPS在调控羟基磷灰石（hydroxyapatite, HAp）矿化中的不同作用，采用非生物、EPS介导和细菌沉淀系统。Zeta电位测量和傅里叶变换红外光谱（Fourier Transform Infrared Spectroscopy, FTIR）表明，细菌细胞和分离EPS均提供带负电、化学性质不同的界面，能够与溶解态Ca²⁺离子相互作用。溶液化学显示，与非生物对照相比，生物系统中磷酸盐和钙离子耗竭更显著，符合晶体沉淀增强。场发射扫描电子显微镜（field emission scanning electron microscopy, FESEM）和Brunauer–Emmett–Teller（BET）分析显示，生物界面产生不同的晶体形貌和表面特征。X射线衍射（X-ray diffraction, XRD）显示相组成存在显著差异：非生物沉淀产生混合磷酸钙相，而EPS介导沉淀促进成核但仍以先驱相为主。相反，全细胞系统有利于HAp形成，其中 Sporosarcina pasteurii 产生相纯结晶HAp，Pseudomonas fluorescens 产生HAp主导的沉淀。酸溶解实验进一步证实生物成因沉淀稳定性提高。这些发现表明，决定羟基磷灰石相演化、晶体生长和矿物稳定性的是细菌表面功能基团的空间组织，而不仅是表面电荷。尽管局部代谢活动可能贡献微环境条件，结果强调细菌细胞表面和EPS是羟基磷灰石生物矿化的关键决定因素，为生物介导矿物材料的设计提供机制基础。

研究背景与问题：微生物诱导矿物沉淀（microbially induced mineral precipitation, MIMP）是广泛存在的自然过程，可形成包括磷酸钙在内的多种磷酸盐矿物。羟基磷灰石（hydroxyapatite, HAp）较CaCO₃溶解度低且耐酸性强，在土木与环境工程、环境修复、生物材料和仿生矿物合成中受到关注。既有研究多将微生物HAp形成归因于酶促磷酸释放，但在磷酸盐已充足时，只要Ca²⁺和磷酸根达到过饱和即可沉淀，因此微生物代谢不能完全解释生物体系中磷酸钙相组成、晶体形貌和稳定性的多样性。细菌细胞表面和胞外聚合物（extracellular polymeric substances, EPS）可提供带负电官能团并结合Ca²⁺，但完整细胞与EPS对矿化的相对贡献不清，尤其缺乏将代谢效应与界面效应分离的微观比较。该研究通过非生物、EPS介导和全细胞系统的比较，评估细菌界面在磷酸盐已存在条件下对HAp矿化的调控作用，并为富磷水体修复和耐久矿物材料设计提供依据。

研究开展与结论/意义：研究人员建立四个沉淀系统：非生物对照、Sporosarcina pasteurii（G⁺）全细胞、Pseudomonas fluorescens（G^?）全细胞以及P. fluorescens来源分离EPS，并补充多聚甲醛（paraformaldehyde, PFA）固定非活细胞实验；结合界面表征、溶液化学、结晶相、形貌、表面性质和酸溶解实验进行比较。结果表明，细菌界面与不同矿化结局相关：全细胞系统更有利于结晶HAp形成并提高耐酸性，S. pasteurii产生唯一检出结晶相为HAp的沉淀；EPS支持沉淀但先驱相比例较高；表面电荷量本身不能预测最终相组成；固定非活细胞仍可形成含HAp沉淀，提示持续细胞活力并非绝对必需。其意义在于区分离子去除、结晶相发育和矿物耐溶解性等不同矿化性能指标，为微生物介导磷酸钙矿化系统设计提供机制依据。

关键技术方法（不超过250字）：采用四个沉淀系统：非生物对照；S. pasteurii（ATCC 11859）全细胞；P. fluorescens（ATCC 13525）全细胞；以及来自48 h P. fluorescens LB培养的分离EPS（作为无细胞聚合物界面模型），并设PFA固定非活细胞补充实验。关键方法包括Zeta电位和FTIR表征界面电荷与官能团；监测溶解态磷酸盐、Ca²⁺和pH；XRD结合参考强度比（Reference Intensity Ratio, RIR）法进行结晶相半定量；FESEM观察形貌；N₂吸附–脱附BET和Barrett–Joyner–Halenda（BJH）分析比表面积与孔结构；pH 4.0乙酸缓冲液酸溶解实验评估耐久性。定量矿化实验设独立生物重复，材料表征采用代表性或混合样品进行描述性分析。

研究结果：3.1 细胞与EPS的界面性质（Interfacial properties of cells and EPS）：Zeta电位显示三者均带负电，S. pasteurii约?25 mV，P. fluorescens约?38 mV，EPS约?49 mV；FTIR显示酰胺I/II、羧酸盐及磷酸基/碳水化合物相关特征，EPS指纹区更复杂，表明细胞与EPS为化学不同的负电界面，但表面电荷不能预测后续相组成。3.2 矿化过程溶液化学与矿物产量（Solution chemistry during mineralization and mineral yield）：5天监测显示生物系统磷酸盐和Ca²⁺耗竭快于非生物，P. fluorescens最快，S. pasteurii次之，EPS居中；全细胞pH升至8.58–8.60，EPS降至约7.8，非生物近8.0；全细胞干重最高但包含生物量或聚合物，不能按纯矿物质量直接比较。3.3 磷酸钙沉淀相组成（Phase composition of calcium phosphate precipitates）：XRD显示非生物为混合相（磷灰石型磷酸钙61 wt%、透钙磷石13 wt%、无水磷酸氢钙26 wt%）；S. pasteurii仅检出HAp；P. fluorescens约92 wt% HAp和约8 wt%无水磷酸氢钙；EPS以monetite样水合磷酸氢钙约63 wt%为主、HAp约37 wt%；上述比例仅指检出结晶相，不含无定形磷酸钙。3.4 FESEM形貌四系统比较（FESEM morphology overview: four-system comparison）：S. pasteurii形成大板状、刻面清晰的晶体并有层叠和细胞尺寸凹痕；P. fluorescens形成放射状花状聚集体且片层嵌入基质样物质；EPS形成较小而不规则颗粒和碎片，组织度较低；非生物为异质聚集体和碎片，尺寸分布宽。PFA固定细胞仍见广泛结晶和HAp，提示活性非绝对必需。3.5 磷酸钙沉淀的比表面积与孔结构（Surface area and pore structure of calcium phosphate precipitates）：EPS沉淀BET最高约56 m² g^?1、BJH累积孔容0.122 cm³ g^?1；非生物约12 m² g^?1和0.041 cm³ g^?1；两全细胞约14 m² g^?1，孔容分别0.059和0.049 cm³ g^?1；平均孔宽11.96–16.93 nm；为混合样品单次描述性测定，不用于推断统计。3.6 酸溶解：量化HAp耐久性（Acid dissolution: quantifying HAp durability）：pH 4.0处理12 h后，非生物保留约10%初始质量，EPS约44%，P. fluorescens约64%，S. pasteurii约70%；趋势与结晶相组成较BET表面积更相关，HAp富集的细菌沉淀更耐酸。

讨论总结：讨论指出磷酸钙可按Ostwald阶段经无定形磷酸钙（amorphous calcium phosphate, ACP）、透钙磷石、无水磷酸氢钙和八钙磷酸盐（octacalcium phosphate, OCP）等中间相形成；ACP未直接检出但不能排除。非生物与EPS系统的混合相提示转化不完全；分离EPS仅为模型界面，不能从全细胞响应中直接扣除；固定细胞支持不依赖活力的界面贡献，但PFA可能改变表面化学，不能证明唯一机制。Zeta电位在0.5 mM KCl、pH 7.4下测定，16 mM Ca²⁺会屏蔽，不能直接外推至沉淀介质；两菌培养基不同也可能影响包膜和EPS。结果支持离子结合官能团的化学身份、可及性和空间组织较净表面电荷更重要；EPS可能贡献P. fluorescens中少量无水磷酸氢钙，但不能确证。酸稳定性主要与相组成一致，BET仅为描述性。应用上不能仅以沉淀产量评价，应联合考虑离子去除、结晶相发育和耐溶解性。

研究结论翻译：本研究证明，在相同初始溶液化学条件下，细菌界面与不同的磷酸钙矿化结果相关。矿化性能通过三项互补标准评价：（i）Ca²⁺和磷酸盐去除的速率与程度；（ii）回收沉淀中结晶HAp的优势度；（iii）所得矿物抗酸溶解能力。这些标准并不直接耦合，表明离子去除更快的系统不一定产生最HAp主导或最耐酸的矿物。主要发现如下：表面电荷程度本身不能预测矿化结果。P. fluorescens实现最快的Ca²⁺和磷酸盐去除，而S. pasteurii尽管在生物界面中Zeta电位负性最弱，却产生唯一检出结晶相为HAp的沉淀；因此P. fluorescens在离子去除动力学上最强，S. pasteurii在结晶HAp优势度上最高。这表明快速离子封存与磷灰石成熟是不同结果，并与净表面电荷之外的界面性质贡献一致，包括离子结合功能基团的化学身份、可及性和空间组织。分离的P. fluorescens来源EPS支持磷酸钙沉淀，但较完整细胞处理产生更富先驱相的结晶组合。P. fluorescens全细胞沉淀中少量无水磷酸氢钙的持续存在可能部分反映细胞相关EPS的影响；但由于未量化全细胞处理中的EPS产量，其贡献不能与G^?细胞包膜效应或残余细胞活性确证性区分。在所研究条件下，持续细胞活力并非HAp沉淀的绝对要求。补充PFA固定非活S. pasteurii和P. fluorescens处理在失去可检测集落形成能力且总体pH变化有限的情况下，产生含HAp结晶沉淀；这些对照与细菌界面处不依赖活力的物理化学相互作用贡献一致，但PFA固定可能改变表面化学，因此不能确立被动细胞表面成核为唯一机制。结果对微生物诱导磷酸钙矿化系统设计具有意义。对于酸性矿山排水修复、地下生物屏障、富磷环境处理和矿物基材料等应用，矿化性能不应仅由沉淀产量评估；离子去除效率、结晶相发育和抗溶解性代表应根据目标应用考虑的不同性能标准。未来工作应检验这些界面效应是否在更广细菌种类、溶液条件和时间尺度上持续；使用EPS耗竭细胞、物种匹配分离EPS和补充表面表征方法将有助于解析细胞包膜化学与胞外聚合物对磷酸钙矿化的相对贡献。