《Frontiers in Pharmacology》：Network pharmacology-based investigation of the therapeutic effects and molecular mechanisms of oxymatrine in psoriasis
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摘要
引言： 银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤病，发病机制复杂，现有治疗药物存在一定局限性。氧化苦参碱（oxymatrine, OMT）是传统中药苦参的主要活性成分，具有抗炎和抗增殖等多种药理作用，但其抗银屑病的分子机制尚未完全阐明。本研究采用网络药理学方法，
摘要
引言： 银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤病，发病机制复杂，现有治疗药物存在一定局限性。氧化苦参碱（oxymatrine, OMT）是传统中药苦参的主要活性成分，具有抗炎和抗增殖等多种药理作用，但其抗银屑病的分子机制尚未完全阐明。本研究采用网络药理学方法，系统剖析了OMT抗银屑病的“成分-靶点-通路”调控网络，以预测其潜在机制，并通过临床标本分析和体外细胞实验进一步验证。
方法： OMT靶点从TCMSP数据库和文献挖掘中收集，银屑病相关靶点来自包括GeneCards在内的5个数据库。经靶点映射后，构建了药物-核心靶点网络和蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络，并确定了包括EGFR、AKT1、JAK2和BCL2在内的核心靶点。进行了基因本体论（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析、分子对接以及100 ns分子动力学（molecular dynamics, MD）模拟。在接受8周OMT治疗的患者中进行了临床验证。将HaCaT角质形成细胞分为对照组、M5细胞因子鸡尾酒诱导模型组、甲氨蝶呤（methotrexate, MTX）阳性对照组和OMT干预组进行体外实验。
结果： 富集分析显示，靶点显著富集于炎症反应调节、凋亡信号传导以及多个JAK/STAT相关通路。OMT对EGFR、JAK1、JAK2和STAT3等核心靶点表现出良好的结合亲和力。值得注意的是，MD模拟验证了OMT-JAK1和OMT-STAT3复合物具有优异的热力学稳定性。临床上，患者的银屑病面积和严重程度指数（Psoriasis Area and Severity Index, PASI）评分显著降低，皮损组织病理学明显改善，异常表达的EGFR-JAK/STAT及凋亡相关分子显著逆转。体外实验中，OMT显著抑制了M5诱导的EGFR-JAK/STAT磷酸化和激活，并恢复了凋亡平衡。
讨论： 这些发现表明，OMT通过抑制EGFR磷酸化、上调SOCS1，从而抑制过度的JAK/STAT信号激活、调节凋亡相关蛋白表达，最终促进角质形成细胞凋亡并抑制其增殖和炎症反应，发挥抗银屑病治疗作用。本研究为OMT在银屑病治疗中的临床应用提供了实验依据。
研究背景与目的
银屑病是一种由多种环境因素共同诱发的、多基因决定的免疫介导的过度增生性炎症性皮肤病，临床表现为反复发作的鳞屑性红斑块，伴有不同程度的瘙痒。该病易复发、病程迁延，给患者带来巨大心理负担，但其确切病因和发病机制至今尚未完全阐明。现有研究表明，银屑病的发生发展涉及T细胞分化、炎症细胞浸润、角质形成细胞增殖等多个环节，而遗传因素、感染、代谢紊乱、内分泌异常以及吸烟、饮酒和心理因素等均可诱发或加重病情。其中，JAK/STAT信号通路的过度激活被认为是银屑病发病的核心机制之一。
目前的治疗方法包括间歇性或长期外用药物。传统的系统性治疗药物主要有甲氨蝶呤（methotrexate, MTX）、阿维A和环孢素，但长期使用副作用显著且停药后复发率高。近年来生物制剂虽疗效显著、起效快，但存在费用高昂、需终身给药、易产生免疫耐受和失调等问题，甚至可能诱发特应性皮炎和心血管疾病，对有感染或恶性肿瘤病史的患者严格禁用。因此，亟需开发疗效好、安全性高、副作用小的新型治疗药物。
氧化苦参碱（oxymatrine, OMT）是从苦豆子根中提取的四环喹诺里西啶类生物碱，具有抗炎、抗纤维化和免疫调节等多种药理活性，已广泛用于病毒性肝炎和心肌炎等多种疾病的治疗，安全性良好，迄今未见严重不良反应报道。研究人员前期的临床研究表明，OMT对银屑病具有显著的治疗效果，其疗效与阿维A相当，但远期效果更优，副作用更少，复发率更低，并具有调节代谢的功能。然而，OMT能否通过调控EGFR-JAK/STAT信号通路来缓解银屑病症状，此前尚无报道。因此，本研究采用网络药理学方法预测OMT治疗银屑病的潜在治疗靶点，构建“成分-靶点-通路-疾病”网络，并通过临床标本分析和体外细胞实验进行验证，旨在阐明其潜在的分子机制，为其临床应用提供理论依据。
主要关键技术方法
研究人员首先从Swiss Target Prediction、BATMAN、HIT和HERB四个数据库获取OMT潜在靶点，并从GeneCards、CTD、PharmGKB、DrugBank和OMIM五个数据库获取银屑病相关靶点，取交集获得109个共同靶点。利用STRING数据库构建蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络，并通过Cytoscape软件进行可视化及拓扑分析筛选核心靶点。采用Metascape平台进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。使用Autodock Vina进行分子对接验证OMT与核心靶点的结合能力，并对OMT-JAK1和OMT-STAT3复合物进行100 ns分子动力学（molecular dynamics, MD）模拟评估结合稳定性。临床方面，纳入2019年7月至2024年10月间的58例重症斑块型银屑病患者，接受OMT静脉输注（0.6 g/100 mL）治疗8周，采集治疗前后皮损活检标本进行检测。体外实验中，采用M5细胞因子鸡尾酒（IL-1α、IL-17、IL-22、TNF-α和制瘤素M）诱导HaCaT角质形成细胞建立银屑病细胞模型，设置对照组、M5模型组、MTX阳性对照组和OMT干预组。
研究结果
3.1 OMT治疗银屑病潜在治疗靶点的预测
研究人员从数据库中筛选出241个OMT靶点和5,616个银屑病疾病靶点，取交集得到109个共同靶点。通过PPI网络拓扑分析，筛选出度值最高的10个核心靶点，包括AKT1、EGFR、CASP3、MMP9、BCL2、IFNG、CYCS、PTEN、PARP1和CASP1。其中，EGFR作为JAK/STAT通路的重要上游调控分子，其信号刺激可上调STAT1磷酸化并诱导STAT1/STAT3与JAK1/JAK2形成复合物。结果表明，OMT可能通过靶向EGFR阻断JAK/STAT通路的过度激活。
3.2 GO和KEGG富集分析
GO功能注释显示，生物学过程（Biological Process, BP）中最显著富集的条目包括炎症反应调节、细胞对氧化应激的反应和凋亡信号通路的调节，这与银屑病持续性炎症浸润、氧化-抗氧化失衡及角质形成细胞异常凋亡的核心病理特征高度一致。细胞组分（Cellular Component, CC）方面，内涵体-溶酶体系统的组分最显著富集。分子功能（Molecular Function, MF）方面，组蛋白去乙酰化酶相关活性最显著富集。KEGG通路富集分析共获得221条功能通路，排名前10的通路包括凋亡、坏死性凋亡、类风湿关节炎、脂质与动脉粥样硬化以及多个感染相关通路，这些通路均与JAK/STAT信号通路存在广泛的交叉调控。
3.3 分子对接与分子动力学模拟
分子对接结果显示，OMT与EGFR的结合能最低（?8.3 kcal/mol），结合活性最优；与JAK2的结合能为?8.0 kcal/mol，两者均低于?8.0 kcal/mol，符合极强结合活性的标准。OMT与BCL2（?7.9 kcal/mol）、JAK1（?7.7 kcal/mol）、STAT3（?7.1 kcal/mol）和SOCS1（?7.1 kcal/mol）的结合能在?7.0至?8.0 kcal/mol范围内，达到有效稳定结合的标准。100 ns MD模拟显示，OMT-JAK1和OMT-STAT3复合物的均方根偏差（root-mean-square deviation, RMSD）分别在15 ns后趋于平衡（约1.8 ?）和全程平稳波动（始终低于2.8 ?），均表现出优异的构象稳定性。氢键分析表明两个复合物均能形成稳定的动态氢键相互作用。
3.4 PASI评分与HE染色
58例重症斑块型银屑病患者经OMT治疗8周后，银屑病面积和严重程度指数（Psoriasis Area and Severity Index, PASI）评分从基线的29.0 ± 7.4显著降至7.6 ± 4.7（P < 0.0001）。HE染色显示，治疗后皮损的典型银屑病病理改变（如表皮角化过度伴局灶性角化不全、颗粒层变薄或消失、棘层肥厚、表皮突规则向下延伸呈杵状或棒状、真皮乳头层增宽水肿、毛细血管迂曲扩张及炎症细胞浸润）均显著减轻。
3.5 免疫组化
免疫组化检测显示，与基线相比，经OMT治疗8周后，患者皮损中JAKs/STAT3通路相关蛋白磷酸化JAK1（p-JAK1）、磷酸化JAK2（p-JAK2）和磷酸化STAT3（p-STAT3）及其上游分子EGFR、凋亡相关蛋白Bcl-2的阳性表达率均显著降低，而SOCS1、Bax和CASP3蛋白的阳性表达率显著升高（P < 0.05）。
3.6 皮损组织中JAKs/STAT3通路及其上下游蛋白表达的Western blotting和qRT-PCR检测
qRT-PCR结果显示，治疗后皮损中负反馈调节因子SOCS1的mRNA表达显著上调，促凋亡因子CASP3和Bax的mRNA表达显著增加，而抗凋亡因子Bcl-2的mRNA表达显著下降（P < 0.05），均接近正常对照组水平。Western blotting结果显示，治疗后p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3和EGFR蛋白表达较治疗前显著降低，SOCS1蛋白表达显著升高；凋亡相关蛋白中，Bcl-2表达显著降低，Bax和CASP3表达显著升高（P < 0.05）。
3.7 CCK-8实验结果
CCK-8实验确定，为尽量减少细胞毒性同时保证可靠的实验条件，后续实验中OMT浓度选用不超过1.5 mg/mL，MTX浓度选用不超过0.1 μmol/mL。
3.8 HaCaT细胞中JAKs/STAT3通路及其上下游蛋白表达的Western blotting和qRT-PCR检测
qRT-PCR结果显示，M5刺激组HaCaT细胞中EGFR及JAK/STAT通路核心分子的mRNA水平较正常组显著升高，而OMT干预后这些分子的表达显著降低，恢复至接近正常组和MTX阳性对照组水平。同时，M5组中SOCS1和促凋亡因子Bax的mRNA表达下调，抗凋亡因子Bcl-2的mRNA表达上调；OMT干预可逆转这些异常。Western blotting结果显示，与M5组相比，OMT组、MTX组和正常组的p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3和EGFR蛋白表达显著降低，而SOCS1、Bax和CASP3蛋白表达显著升高（P < 0.05）。
讨论与结论
本研究表明，OMT通过靶向EGFR-JAK/STAT信号轴发挥抗银屑病治疗作用。具体而言，OMT从三个层面发挥作用：一是抑制上游EGFR受体激活，从源头阻断信号输入；二是通过与JAK1和JAK2催化结构域稳定结合，双靶点抑制激酶活性，阻断下游信号转导；三是上调负反馈调节因子SOCS1的表达，增强对JAK激酶的抑制作用。同时，OMT直接调控凋亡相关蛋白BCL2、Bax和CASP3的表达，恢复角质形成细胞的凋亡稳态。此外，OMT还通过凋亡、坏死性凋亡和脂质与动脉粥样硬化等多个交叉通路协同作用，全面改善银屑病的病理损伤，恢复皮肤生理稳态。
研究结论：OMT通过抑制EGFR磷酸化、上调SOCS1，从而抑制过度的JAK/STAT信号激活，调节凋亡相关蛋白表达，最终促进角质形成细胞凋亡并抑制其增殖和炎症反应，发挥抗银屑病治疗作用。本研究阐明了通路与靶蛋白之间的协同调控关系，填补了当前研究的知识空白，完善了天然生物碱干预自身免疫性皮肤病的机制理论，为银屑病的靶向治疗提供了新方向，并为OMT的临床应用和新药开发提供了理论支持。
