《Analyst》：A chitosan leaky waveguide biosensor for measurement of DNA biomarkersOpen Access
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可持续聚合物（如壳聚糖）在包括传感在内的多种应用中日益受到青睐。已有研究报道了采用壳聚糖纳米复合电极的电化学传感器，但使用未掺杂的壳聚糖可以降低传感器成本。沉积在玻璃基底上的壳聚糖薄膜可作为光学无标记泄漏波导（LW）传感器，与其他光学传感器相比，具有高灵敏度和
可持续聚合物（如壳聚糖）在包括传感在内的多种应用中日益受到青睐。已有研究报道了采用壳聚糖纳米复合电极的电化学传感器，但使用未掺杂的壳聚糖可以降低传感器成本。沉积在玻璃基底上的壳聚糖薄膜可作为光学无标记泄漏波导（LW）传感器，与其他光学传感器相比，具有高灵敏度和低成本的优势。在此，研究人员首次报道了用于序列特异性定量约7.9 kDa靶DNA的壳聚糖LW生物传感器。本工作所选靶DNA序列与低级别非肌层浸润性膀胱癌密切相关。壳聚糖LW生物传感器在无需扩增的情况下，对缓冲液中的靶DNA实现了1.4 nM的检出限（LOD），分析时间为30分钟。相比之下，在50%和100%合成尿液中靶DNA的LOD分别为18.7和33.2 nM。
壳聚糖是一种源自甲壳素的可持续聚合物，具有可再生性、成膜能力强和胺基易化学修饰等优点，在传感等领域受到广泛关注。已有研究采用壳聚糖纳米复合电极进行电化学DNA传感，但未掺杂的壳聚糖有望降低传感器成本。本研究首次报道了基于壳聚糖薄膜的泄漏波导（LW）无标记光学生物传感器，用于序列特异性定量约7.9 kDa的靶DNA。该靶DNA序列与低级别非肌层浸润性膀胱癌密切相关，因此对非侵入性癌症检测具有重要意义。
研究人员采用旋涂法在玻璃基底上制备壳聚糖薄膜，构建LW传感器，并通过测量不同浓度甘油溶液引起的共振角位移评估其折射率灵敏度（RIS）。结果显示，平均RIS为122.2 ± 4.6度/RIU，器件间变异小于4%。利用不同分子量线性聚乙二醇（PEG）评估膜孔隙率，发现6 kDa和35 kDa PEG的响应比甘油分别低约19%和36%，表明壳聚糖LW适用于数十kDa级别DNA的灵敏检测。在DNA传感实验中，研究人员优化了捕获探针的固定条件，发现将操作温度升至40 °C并在缓冲液中添加50 mM氯化钠可显著减少非特异性结合，实现选择性检测。在优化条件下，100 nM靶DNA引起分析通道共振角显著变化，而野生型DNA几乎无响应，表明传感器具有序列特异性。
关键技术方法包括：将壳聚糖溶液旋涂于玻璃基底制备薄膜，利用戊二醛交联；使用650 nm发光二极管（LED）产生楔形光束激发泄漏波导模式；采用双通道微流控池，以参考通道扣除背景漂移；通过静电吸附将互补捕获探针固定在壳聚糖膜中；采用初始结合速率法构建校准曲线并计算检出限。
研究结果如下：
**3.1 初步研究**
**3.1.1 折射率灵敏度（RIS）**：通过向分析通道依次注入不同浓度的甘油溶液，记录差分共振角变化，测得6个传感器的平均RIS为122.2 ± 4.6度/RIU，表明器件间一致性良好。
**3.1.2 壳聚糖LW的孔隙率**：使用不同分子量的PEG评估膜内扩散能力，发现6 kDa和35 kDa PEG的信号比甘油分别低约19%和36%，说明壳聚糖膜可允许数十kDa大小的DNA分子扩散，满足DNA传感需求。
**3.2 DNA传感**
初始在25 °C下，捕获探针和靶DNA在参考通道中发生明显非特异性结合。通过优化封闭反应时间、捕获探针浓度、操作温度和盐浓度，特别是将操作温度提升至40 °C并在PBS中添加50 mM氯化钠后，选择性显著提高。在优化条件下，靶DNA引起分析通道共振角明显变化，而野生型DNA无响应，表明传感器可特异性识别互补序列。
**3.2.1 校准曲线、LOD和分析时间**：使用20–100 nM的靶DNA构建校准曲线，发现初始结合速率与靶DNA浓度在5–30 min内呈良好线性。选择30 min结合时间获得最低检出限（LOD）为1.4 nM，相关系数为0.9998。与其他无标记生物传感器相比，该LW传感器的LOD优于光学回音壁模式（WGM）和多孔硅波导传感器，但逊于电化学和纳米等离子体传感器；然而，LW传感器仅需旋涂制备，成本低，适合高负担疾病的监测。
**3.2.2 样本基质（合成尿液）的影响**：直接注入合成尿液会导致差分共振角增加，但撤去后信号恢复至基线，表明尿液成分未发生不可逆结合。在50%和100%合成尿液中配制靶DNA进行检测，灵敏度分别比缓冲液低约16%和46%，LOD分别为18.7 nM和33.2 nM。性能下降可能归因于合成尿液与缓冲液的盐组成差异，但该传感器可与电动力学富集技术（如等速电泳）集成，用于尿液中循环肿瘤DNA（ctDNA）的检测。
**3.3 壳聚糖LW的存储稳定性**：将传感器在室温下储存于100 mM HEPES（pH 7.4）并包裹铝箔，12个月内RIS保持为125.8 ± 7.6度/RIU，与新鲜制备的器件相当，表明其具有良好的存储稳定性。
讨论部分指出，壳聚糖LW的工作原理依赖于光在波导膜内的全内反射和菲涅尔反射，共振角随膜折射率变化。壳聚糖膜的多孔结构提高了折射率灵敏度，而温度和盐浓度的优化对于降低非特异性吸附至关重要。尽管LW传感器的LOD不如某些电化学和纳米等离子体传感器，但其制造工艺简单、成本低，且完全由介电材料构成，可与电动力学样品富集技术结合，进一步提升检测能力。
研究结论翻译如下：研究人员报道了一种用于定量单链肿瘤DNA（ssDNA）生物标志物的壳聚糖LW生物传感器。壳聚糖LW对甘油溶液的折射率灵敏度为122.2 ± 4.6度/RIU。对于靶DNA传感，通过静电吸引将互补捕获探针固定在壳聚糖薄膜中。研究人员考察了封闭反应时间、捕获探针浓度、氯化钠添加和温度等条件，其中温度和盐浓度对捕获探针固定及靶DNA结合影响最大。在优化条件下，该生物传感器对缓冲液中约7.9 kDa靶DNA的检出限为1.4 nM，分析时间为30分钟。相比之下，在50%和100%合成尿液中靶DNA的LOD分别为18.7 nM和33.2 nM。壳聚糖LW生物传感器可与电动力学样品富集技术集成，用于尿液中循环肿瘤DNA的检测。
