聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架经生物活性弹性蛋白样多肽涂层修饰增强细胞-材料相互作用并支持成骨分化

《Biomaterials Science》：Bioactive ELP-coated scaffolds enhance cell–material interactions and support osteogenic differentiationOpen Access

　　

中文摘要翻译 聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）支架因其生物可降解性和机械强度被广泛应用于组织工程；然而，其固有的疏水性和生物惰性常导致初始细胞附着不良，这是实现稳定组织整合的关键瓶颈。在本研究中，研究人员开发了一种模块化双层表面功能化策略，该策略将聚-L-赖氨酸（PLL）静电引发层与一种含有RGD和YIGSR基序的重组弹性蛋白样多肽（RY-ELP）相结合。顺序的PLL/RY-ELP涂层显著增强了表面润湿性，同时未损害支架互连的多孔结构。这种生物活性界面支持了HEK293细胞（作为弱贴壁模型）和人牙髓干细胞（hDPSCs）的稳健早期黏附和存活。从机制上讲，这种增强的相互作用伴随着黏着斑相关信号通路（包括FAK、桩蛋白和ERK）的快速激活，以及整合素β1和纽蛋白表达的上调。除了促进初期存活外，PLL/RY-ELP涂层还有效促进了hDPSCs的成骨分化，表现为成骨标志物（RUNX2、COL1A1、ALPL、SP7和BGLAP）表达增加和更优的基质矿化。这些发现表明，将静电引发与序列定义的生物活性基序相结合，为克服PLGA支架在再生医学中的生物学局限性提供了一种通用且有效的方法。

论文解读文章

研究背景

组织工程旨在通过整合支架、细胞和生物活性信号来修复或替换受损组织。其中，支架不仅作为三维结构支撑，更是调节细胞黏附、信号传导和命运决定的动态界面。聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）因其生物可降解性、良好的加工性以及获得美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）批准而成为最广泛使用的合成聚合物之一。然而，PLGA固有的疏水性和缺乏细胞识别基序严重限制了高效的初始细胞黏附。这一缺陷会损害整合素介导的信号通路，包括黏着斑激酶（FAK）、桩蛋白和ERK的激活，而这些通路对于后续的细胞铺展、迁移和分化等细胞功能至关重要。因此，亟需有效的表面改性策略来改善PLGA支架的生物活性。弹性蛋白样多肽（ELPs）是一种基因工程生物聚合物，其模块化特性允许精确地掺入生物活性肽基序，从而实现对细胞-材料相互作用的合理调控。本研究假设，结合聚-L-赖氨酸（PLL）和含有RGD及YIGSR基序的生物活性ELP（RY-ELP）的双重涂层策略，能够协同调节早期黏附动力学及随后的细胞反应，最终促进成骨分化。

研究内容与结论

为验证上述假设，研究人员制备了四种实验组支架：未改性的PLGA支架、PLL涂层的PLGA（P-PLGA）、RY-ELP涂层的PLGA（E-PLGA）以及PLL/RY-ELP双重涂层的PLGA（PE-PLGA）。通过系统评估支架形态、润湿性、分钟尺度的早期黏附信号、细胞存活率以及人牙髓干细胞（hDPSCs）的成骨分化能力，本研究旨在阐明组合式表面功能化如何调节从早期细胞-材料相互作用到成骨成熟的级联过程。研究结果表明，PLL/RY-ELP双重涂层策略在不改变支架多孔结构的前提下，显著增强了表面亲水性。该生物活性界面有效支持了弱贴壁细胞和干细胞的早期黏附与存活。机制上，这种增强作用与FAK、桩蛋白和ERK等黏着斑相关信号的快速激活以及整合素β1和纽蛋白的表达上调有关。更重要的是，该涂层有效促进了hDPSCs的成骨分化，表现为成骨标志物基因（如RUNX2、COL1A1、ALPL、SP7和BGLAP）表达升高和基质矿化增强。这些发现证实，将静电引发与序列定义的生物活性基团相结合，是克服PLGA支架生物学局限性的有效策略。

关键技术方法

1. 1.
   盐析/溶剂浇铸法：用于制备多孔PLGA支架。
2. 2.
   逆转变循环纯化法：用于纯化重组表达的RY-ELP蛋白。
3. 3.
   扫描电子显微镜（SEM）：用于观察支架的形貌和多孔结构。
4. 4.
   水接触角测量：用于评估支架表面的亲疏水性。
5. 5.
   活/死细胞染色：用于评估支架上细胞的存活率和黏附面积。
6. 6.
   免疫印迹分析：用于检测细胞黏附相关信号蛋白（如FAK、桩蛋白、ERK、整合素β1和纽蛋白）的磷酸化和表达水平。
7. 7.
   逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和微滴数字PCR（ddPCR）：用于定量分析成骨分化标志基因（如RUNX2、COL1A1、ALPL、SP7、BGLAP）的mRNA表达水平。
8. 8.
   茜素红S染色及定量：用于评估细胞外基质的钙沉积，即矿化程度。

研究结果

3.1 RY-ELP合成与PLGA支架制备

通过AlphaFold预测了RY-ELP的三维结构，显示RGD和YIGSR基序沿聚合物链分布。SDS-PAGE分析确认了分子量约50 kDa的高纯度重组蛋白成功表达。温度依赖性浊度分析显示RY-ELP在19.8 μM浓度下的加热转变温度为31.72 °C，表明其具有温敏性。

3.2 PLGA支架的表面形态及RY-ELP涂层验证

SEM图像显示所有支架均呈现互连多孔结构，各组的平均孔径无统计学差异，表明涂层不影响支架基本形貌。丽春红S染色证实RY-ELP成功分布在E-PLGA和PE-PLGA支架的外表面及内部孔隙中。涂层保留实验显示，在水溶液和培养基中孵育后，RY-ELP仍能部分保留在支架上。

3.3 水接触角测量

未改性PLGA支架的水接触角为114.2 ± 4.1°，呈疏水性。所有涂层支架的接触角均显著降低，其中PE-PLGA最低（59.2 ± 5.5°），其次是E-PLGA（66.8 ± 4.7°）和P-PLGA（90.1 ± 5.7°），表明PLL/RY-ELP涂层有效改善了表面亲水性。

3.4 细胞存活与黏附评估

在HEK293细胞和hDPSCs中，与未改性PLGA相比，E-PLGA和PE-PLGA均显著提高了细胞存活率和黏附面积。PE-PLGA在所有组中表现出最优的细胞响应。与不含黏附基序的对照ELP相比，RY-ELP显示出更强的促细胞黏附效果，证明其生物活性归因于RGD和YIGSR基序。

3.5 支架上细胞黏附相关信号的免疫印迹分析

在接种后15分钟，E-PLGA和PE-PLGA上的FAK和桩蛋白磷酸化水平显著高于PLGA，PE-PLGA还表现出更高的纽蛋白、整合素β1表达和ERK磷酸化。在1小时时，信号模式发生动态变化，FAK磷酸化和纽蛋白表达在各组间不再有显著差异，而桩蛋白磷酸化在E-PLGA和PE-PLGA上仍保持较高水平。与对照ELP的比较进一步证实，RY-ELP序列而非ELP骨架本身促进了早期黏附信号的激活。

3.6 成骨分化分析与矿化实验

RT-qPCR结果显示，PE-PLGA在所有检测的成骨标志基因（RUNX2、COL1A1、ALPL、SP7、BGLAP）上均表现出最高的相对表达水平。ddPCR的绝对定量结果与之相符，证实了PE-PLGA对转录活性的真实增强作用。茜素红S染色及定量分析显示，PE-PLGA在整个培养周期内（第1、3、7天）均表现出最强的钙沉积，表明其促进了功能性基质矿化。

总结与结论

本研究证实，结合PLL引发层和含RGD/YIGSR的RY-ELP的双层表面功能化策略，在不显著改变PLGA支架多孔结构的前提下，改善了其细胞-材料界面。PLL/RY-ELP涂层创造了一个更有利于细胞的支架表面，并在体外实验中支持了增强的细胞存活、附着、早期黏附相关信号传导以及成骨标志物的表达。与对照ELP的额外比较进一步证实，改善的细胞反应与含有黏附基序的RY-ELP序列相关，而非单独的ELP骨架。综上所述，这些发现表明，将电荷介导的表面引发与生物活性RY-ELP涂层相结合，可能为提高基于PLGA的支架在骨和牙科组织工程应用中的生物学性能提供一种有用的策略。