《Frontiers in Sustainable Food Systems》：Corynebacterium glutamicum single-cell protein produced with fermented spent coffee grounds extract supports L-lactate and acetate production by lactic acid bacteria and bifidobacteria
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摘要专业翻译
废弃咖啡渣（SCG）含有大量有机物，但其中大部分不易被微生物培养直接利用。本研究评估了发酵咖啡渣（FSCG）提取物作为谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）单细胞蛋白（SCP）生产的营养来源，并评估所得生物质作为乳
摘要专业翻译
废弃咖啡渣（SCG）含有大量有机物，但其中大部分不易被微生物培养直接利用。本研究评估了发酵咖啡渣（FSCG）提取物作为谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）单细胞蛋白（SCP）生产的营养来源，并评估所得生物质作为乳酸菌和双歧杆菌生产L-乳酸和乙酸的底物。SCG经过固态发酵，选择每日搅拌15天随后静态培养30天产生的FSCG提取物用于C. glutamicum-SCP生产。在5%（w/v）浓度下，所选提取物产生4.91 g/L的回收SCP；相应数值在最小培养基中为4.76 g/L，在复合培养基中为4.85 g/L。FSCG提取物来源和复合培养基来源的C. glutamicum-SCP均含有酸水解性鼠李糖、阿拉伯糖/半乳糖、甘露糖和葡萄糖，以及碱可提取糖原。两种SCP制剂均支持乳酸菌和双歧杆菌菌株依赖性的L-乳酸和乙酸生产。在22菌株混合培养中，复合培养基来源的C. glutamicum-SCP乙酸产量达到1.83 mg/mL，FSCG提取物来源的C. glutamicum-SCP达到2.28 mg/mL。两个数值均显著高于含葡萄糖条件下的产量，且FSCG提取物来源的C. glutamicum-SCP乙酸产量显著高于复合培养基来源的C. glutamicum-SCP。这些发现为将SCG资源化利用与C. glutamicum-SCP生产相结合提供了概念验证，并证明所得SCP支持乳酸菌和双歧杆菌后续的有机酸形成。
论文解读
一、研究背景与目的
农业和畜牧业作为膳食蛋白质的主要供给系统，贡献了相当份额的人为温室气体排放，并需要大量土地和水资源。在资源枯竭、粮食安全担忧以及健康饮食需求日益增长的背景下，开发可持续的替代蛋白来源已成为迫切需求。单细胞蛋白（single-cell protein, SCP）作为微生物蛋白含量丰富的生物质，受气候和地理位置等环境因素制约较小，可通过受控发酵过程实现全年生产，因而成为一种有前景的替代蛋白平台。咖啡是全球消费最广泛的饮料之一，每年产生数百万吨废弃咖啡渣（spent coffee grounds, SCG）作为咖啡冲泡的主要副产物。尽管SCG有机质含量高且组成相对稳定，已被探索用于生物能源、生物聚合物、碳材料、堆肥、建材、食品相关成分和生物炼制等多种资源化途径，但许多SCG资源化技术仍停留在实验室或早期示范阶段，大规模收集、加工和回收系统尚未广泛建立。因此，小型咖啡店产生的SCG仍常通过传统废物流被丢弃。利用SCG来源底物进行微生物SCP生产，可能为通过替代蛋白生产实现该废物流的资源化利用提供策略。
谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）作为成熟的氨基酸生产菌，近年来因其SCP在中试规模下粗蛋白含量约60%、可消化必需氨基酸评分达102而受到关注。虽然SCG水解物已被评估为工程化C. glutamicum代谢物生产的底物，但关于发酵SCG来源营养物用于C. glutamicum-SCP生产以及所得生物质后续可发酵性的信息仍然有限。本研究通过固态发酵生产FSCG提取物，评估其作为C. glutamicum生长和SCP生产的营养来源，并进一步评估所得C. glutamicum-SCP支持乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）和双歧杆菌生产L-乳酸和乙酸的能力。
二、主要技术方法
研究人员采用固态发酵结合热水提取制备FSCG提取物。SCG取自韩国富川当地咖啡店，干燥后使用以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为主的商业混合微生物发酵接种剂进行五种不同静置与搅拌组合模式的固态发酵。热水提取后经离心、过滤和冻干获得FSCG提取物。采用反相高效液相色谱（HPLC）测定咖啡因和葫芦巴碱浓度，采用Folin-Ciocalteu法测定总酚含量。C. glutamicum ATCC 13032在不同培养基中培养生产SCP，经玻璃珠珠磨破碎、高温灭菌和冻干获得SCP粉末。采用BCA蛋白测定试剂盒检测蛋白浓度，采用酶法试剂盒分析单糖组成，采用KOH碱提取法结合酶法试剂盒检测糖原含量。22株LAB和双歧杆菌菌株均购自韩国典型培养物保藏中心（KCTC）和韩国微生物保藏中心（KCCM），在添加不同营养条件的半合成培养基中厌氧培养，采用酶法试剂盒测定L-乳酸和乙酸产量。
三、研究结果
3.1 SCG的固态发酵。 SCG中大量有机资源以不溶性聚合物形式嵌埋于基质中，且残留的生物活性化合物可能抑制微生物生长。研究发现C. glutamicum生长随咖啡因和葫芦巴碱浓度升高而下降，其中咖啡因的抑制作用更为明显。这为采用微生物发酵作为生物预处理提供了依据。由于商业接种剂以B. subtilis为主，其产多种水解酶和通过内生孢子耐受不利条件的能力为选择该接种剂提供了生物学合理性。
3.2 发酵降低生物活性化合物及FSCG提取物支持C. glutamicum生长的能力。 未发酵SCG提取物中葫芦巴碱浓度已较低，约为4 μg/mg提取物。所有FSCG提取物的总酚含量较未发酵SCG提取物降低约40%–60%，表明该降低与微生物发酵相关而非特定发酵模式所致。所有含搅拌阶段的模式下咖啡因浓度降低约76%–92%，而纯静态发酵仅降低约25%，表明氧气暴露和混合影响微生物活性从而促进咖啡因的酶促转化或去除。在搅拌后静置序列中，将静置阶段从15天延长至30天（TS2）在6%及以下提取物浓度时观察到比TS更高的生长响应。研究人员选择5%（w/v）TS2-FSCG提取物用于C. glutamicum-SCP生产，因为该组合在测试的模式-浓度组合中产生最高最终OD600。
3.3 利用FSCG提取物生产C. glutamicum-SCP。 与最小培养基相比，FSCG提取物支持更高的最终OD600，但仍低于复合培养基。蛋白浓度为FSCG提取物0.67 mg/mL、最小培养基0.43 mg/mL、复合培养基0.80 mg/mL。FSCG提取物的回收SCP产量占投入干培养基固形物为0.10 g/g，低于最小培养基的0.19 g/g和复合培养基的0.16 g/g。然而FSCG提取物产生4.91 g/L回收SCP，与最小培养基的4.76 g/L和复合培养基的4.85 g/L相当，支持FSCG提取物用于C. glutamicum-SCP生产的功能适用性。
3.4 C. glutamicum-SCP的碳水化合物组成。 酸水解C. glutamicum-SCP释放鼠李糖、阿拉伯糖/半乳糖和甘露糖，与阿拉伯半乳聚糖和含甘露聚糖脂聚糖的已知组成一致。FSCG提取物来源C. glutamicum-SCP的阿拉伯糖/半乳糖和甘露糖组分高于复合培养基来源SCP，可能反映培养基依赖性细胞被膜碳水化合物组成差异、残留SCG来源碳水化合物的结合或两者兼有。酸水解还释放葡萄糖，碱提取部分独立检测到糖原。在无外加葡萄糖的LB或含0.2%葡萄糖的BHI中生产的C. glutamicum-SCP，细胞被膜相关糖可测量而葡萄糖和糖原低于可靠定量范围，表明糖原对葡萄糖组分有贡献且FSCG提取物提供了足以支持糖原积累的可利用碳水化合物。水解前游离单糖低于可靠定量范围，表明水解后定量的糖主要以糖苷键结合的碳水化合物组分存在。
3.5 LAB和双歧杆菌利用C. glutamicum-SCP生产L-乳酸和乙酸。 在仅基础培养基条件下，L-乳酸和乙酸测量值低于可靠定量范围。不含葡萄糖的酪蛋白水解物对大多数菌株支持很少或不支持L-乳酸生产，而部分菌株检测到低浓度乙酸。当酪蛋白水解物和葡萄糖同时供应时，大多数LAB菌株呈L-乳酸主导型，而双歧杆菌菌株通常产生更多乙酸，与其各自的碳水化合物发酵途径一致。当酪蛋白水解物和葡萄糖被C. glutamicum-SCP替代时，LAB的L-乳酸产量和双歧杆菌的乙酸产量普遍下降，但两种SCP制剂均支持可测量的菌株依赖性L-乳酸和乙酸生产。部分LAB菌株在SCP条件下的乙酸产量高于含葡萄糖对照，其中鼠李糖乳酪杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）、干酪乳酪杆菌（Lacticaseibacillus casei）、卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）和副干酪乳酪杆菌副干酪亚种（Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei）在SCP条件下产生1.42–2.23 mg/mL乙酸。
3.6 22菌株混合培养中的L-乳酸和乙酸生产。 在酪蛋白水解物条件（不加葡萄糖）下L-乳酸产量极低。添加葡萄糖使L-乳酸从0.07增至2.20 mg/mL，而乙酸保持相对较低的0.47 mg/mL。当酪蛋白水解物和葡萄糖被C. glutamicum-SCP替代时，L-乳酸浓度保持在0.59 mg/mL以下，而乙酸增至复合培养基来源SCP的1.83 mg/mL和FSCG提取物来源SCP的2.28 mg/mL。成对比较显示两种SCP制剂的乙酸产量均显著高于含葡萄糖条件。FSCG提取物来源C. glutamicum-SCP的乙酸产量显著高于复合培养基来源C. glutamicum-SCP，可能反映其相对丰富的非葡萄糖碳水化合物组分被22菌株联合体集体利用。
四、讨论与结论
讨论部分指出，FSCG提取物来源C. glutamicum-SCP含有较大的阿拉伯糖/半乳糖和甘露糖组分，而复合培养基来源SCP含更多葡萄糖和糖原。较高的乙酸产量不能简单归因于任何单一碳水化合物组分，但可能反映其相对丰富的非葡萄糖碳水化合物组分的集体利用。由于不同LAB和双歧杆菌菌株的聚糖利用能力存在差异，这些非葡萄糖碳水化合物组分可能扩大了22菌株联合体可利用底物的范围并促进其更高的乙酸产量。研究结论为：固态发酵结合热水提取将SCG转化为能够支持C. glutamicum生长和SCP生产的FSCG提取物；搅拌后静置序列产生的FSCG提取物在降低咖啡因和总酚含量的同时支持C. glutamicum生长；所选FSCG提取物支持与最小培养基和复合培养基相当体积规模的SCP生产；C. glutamicum-SCP含有细胞被膜相关的鼠李糖、阿拉伯糖/半乳糖和甘露糖组分以及葡萄糖组分和糖原；两种SCP制剂在单菌培养和22菌株混合培养中均支持LAB和双歧杆菌菌株依赖性的L-乳酸和乙酸形成；在混合培养中两种SCP条件的乙酸产量均显著高于含葡萄糖条件，且FSCG提取物来源SCP的乙酸产量显著高于复合培养基来源SCP。该顺序过程为将SCG资源化利用与微生物蛋白生产和下游微生物发酵相结合提供了视角，但需在生理相关的胃肠道或结肠发酵模型中进一步验证。
