埃塞俄比亚西哈勒尔盖地区贮藏菜豆（Phaseolus vulgaris L.）品种种传真菌的发生与多样性研究

《Advances in Agriculture》：Occurrence and Diversity of Seed-Borne Fungi Associated With Stored Common Bean (Phaseolus vulgaris L.) Varieties in West Hararghe Zone, Ethiopia

　　

摘要专业翻译 菜豆（Phaseolus vulgaris L.）生产是西哈勒尔盖地区农业和粮食安全的重要组成部分。然而，由种传真菌病原体引起的采后损失是制约生产力的主要障碍。本研究旨在鉴定与贮藏菜豆品种相关的真菌区系（mycoflora），并评估其对种子萌发的影响。研究人员采用目的性抽样方法，从三个主要地区（安查尔、古巴科里查和奇罗）采集了三个菜豆品种（Nasir、Awash-1和Awash-2）的45份样品。采用直接平板法（direct plating technique）对菜豆种子相关种传真菌进行分离和鉴定。来自古巴科里查的Nasir品种表现出最高的平均水分含量（13.56%），而最低平均值（9.20%）出现在来自奇罗地区的Awash-1品种中。真菌分离和鉴定采用标准琼脂平板法进行，致病性通过种子接种和萌发试验评估。在2250粒接种种子中，1267粒被感染，平均感染率为56.3%（范围为40%至88%）。共分离鉴定出9个真菌属、15个真菌种。Fusarium 属在分离物数量上最为优势（385株），其次是 Aspergillus（346株）、Alternaria（164株）、Penicillium（86株）、Macrophomina（85株）和 Rhizoctonia（77株）。然而，Alternaria alternata 表现出最高的发生频率，出现在86.7%的种子样品中，其次是 Fusarium spp.，为75.6%。在所研究的地区中，古巴科里查表现出最高的真菌感染水平，尤其是Nasir品种，感染率达到77.6%。方差分析（ANOVA）证实，四个致病性分离物（Macrophomina phaseolina、Rhizoctonia solani、Fusarium oxysporum 和 Alternaria alternata）成功诱导了根腐病症状。其中，Rhizoctonia spp. 表现出最高的致病力，导致显著更高的病害发生率（DI），高达95%（p ≤ 0.05），而对照组仅为0%–40%。此外，所有接种处理均表现出高于未接种对照的病情严重度指数（PSI）值。研究得出结论，以 Fusarium、Aspergillus 和 Alternaria 为主的多种种传真菌与西哈勒尔盖地区选定地区的贮藏菜豆种子密切相关。这种污染对种子活力和幼苗健康均产生不利影响。这些发现强调了改进种子贮藏实践和制定有效的、针对特定地点的病害管理策略的迫切需求。未来研究应纳入分子工具进行物种鉴定，以确认分类学准确性并评估贮藏种子中关键真菌病原体的遗传多样性，从而保障作物品质。

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一、研究背景与意义

菜豆（Phaseolus vulgaris L.）在埃塞俄比亚是仅次于蚕豆的第二大重要谷类豆科作物。2021/22年度生产季，菜豆约占全国谷类作物总面积的2.79%（约339,350.34公顷），贡献了全国谷物总产量的1.78%（约584万吨）。在奥罗米亚地区，菜豆种植面积约14万公顷，总产量25.2万吨，平均产量1.85吨/公顷。西哈勒尔盖地区是当地主要的菜豆产区之一，2021/22年度种植面积达14,924.62公顷，产量约23万吨，平均生产力为1.5吨/公顷。菜豆在当地农户家庭收入创收和粮食安全中发挥着重要作用，具有较高的营养价值。

然而，埃塞俄比亚菜豆的平均产量（1.5–1.8吨/公顷）远低于该作物超过3吨/公顷的遗传潜力。多种由真菌病原体引起的病害导致种子变色、劣变和皱缩。种子是多种真菌传播的重要载体，可将新病原体引入此前未受感染的区域。真菌是菜豆中最主要的种传病原体类群，因其能在种子内部建立菌丝结构并保持休眠状态而往往难以控制。菜豆种子的真菌感染可能发生在田间和采后贮藏期间。尽管已有关于西哈勒尔盖地区新鲜收获菜豆种子种传真菌病原体的研究，但关于贮藏种子相关真菌的信息仍然有限，对贮藏菜豆中真菌区系的了解不足，亟需改进种子检验和质量控制措施。因此，本研究旨在调查贮藏菜豆种子中真菌的多样性并评估其对种子萌发的影响，以填补该地区的研究空白。

二、研究设计与技术方法

研究人员在埃塞俄比亚东部奥罗米亚国家民族州西哈勒尔盖地区的三个地区（奇罗、古巴科里查和安查尔）开展研究，这些地区海拔范围1626–2096米。研究人员采用目的性抽样方法，根据菜豆生产潜力、可达性和总种植面积选择了三个主要菜豆产区。在每个地区内随机选择有代表性的kebele（农民协会），基于农户的生产能力和收获后至少贮藏菜豆种子3个月的能力确定调查对象。从农户的贮藏设施（袋子）中采集了三个品种（Awash-1小粒白色、Awash-2白色和Nasir红色）的种子样品，从每个贮藏袋的上、中、下三个位置取样，混合形成1公斤的混合样品。种子水分含量使用Draminski GMM微型水分测定仪测定。真菌分离采用直接平板法，分别在Oda Bultum大学（OBU）植物科学实验室和哈拉马亚大学（HU）作物保护实验室独立进行验证。种子经表面消毒后置于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上，在28±2°C条件下培养7天。真菌鉴定基于培养形态学特征（颜色、大小、形状）和显微特征（分生孢子和分生孢子梗的形状和大小、隔膜数量），并与分类学鉴定检索表中的物种描述进行比较。致病性评估通过人工接种试验在受控条件下进行，选用对多种土壤和种子相关真菌病原体敏感的墨西哥142品种作为感病测试寄主。种子萌发试验在灭菌沙土中进行，监测播种后5至15天的萌发情况。统计分析使用SAS 9.4版本，包括描述性统计、方差分析（ANOVA）、Fisher最小显著差数（LSD）检验和Pearson相关性分析。

三、主要研究结果

3.1 贮藏菜豆品种种子的水分含量

方差分析显示，地区（p < 0.001）、品种（p < 0.05）及其交互作用（p < 0.001）对贮藏菜豆种子样品的水分含量有显著影响。在所有品种和地区中，来自古巴科里查的Nasir品种记录了最高的平均水分含量（13.56%），范围为12.10%至14.70%。相比之下，来自奇罗地区的Awash-1品种观察到最低的平均水分含量（9.20%），范围为8.00%至10.00%。在奇罗地区内，Awash-2（11.40%）和Nasir（11.68%）的水分含量显著高于Awash-1（9.20%）。品种间的显著差异与先前评估23个埃塞俄比亚菜豆品种的研究一致，该研究报告了水分含量的显著变异，范围为9.33%至10.61%，支持基因型差异影响水分含量的观点。贮藏环境条件在决定种子水分动态中起关键作用，这可能解释了本研究各地区间观察到的变异性。

3.2 贮藏菜豆种子的总真菌感染

研究共分析了来自三个地区的三个菜豆品种的2250粒贮藏种子，其中1267粒被发现感染，总体平均感染率为56.3%，范围为40%至88%。方差分析表明，品种、地区及其交互作用对贮藏菜豆种子真菌感染百分比有高度显著影响（p < 0.001）。来自古巴科里查地区的Nasir品种记录了最高感染水平（77.6%），范围为70%至88%，其次是同一地区的Awash-1品种，感染率为61.2%。在所有地区中，Nasir品种的种子始终表现出显著高于其他品种的感染水平，表明Nasir在贮藏条件下对真菌感染更为敏感。此外，来自古巴科里查地区的所有品种均表现出显著高于其他地区的真菌感染。这种变异可能与种皮特性的差异有关，种皮完整性在限制真菌入侵中发挥重要作用。研究中观察到的相对较高的感染水平可能归因于不适当的贮藏条件和升高的种子水分含量。高水分含量为真菌生长和增殖创造了有利环境。

3.3 菜豆种传真菌区系的分离与鉴定

基于培养和形态学特征，所有真菌分离物被分为八个表型不同的属：Fusarium、Aspergillus、Alternaria、Penicillium、Rhizoctonia、Rhizopus、Trichoderma 和 Chaetomium。由于物种水平的鉴定仅基于培养和形态学特征且未经分子分析支持，物种分配被认为是推定性的而非确定性的。研究共鉴定出15个真菌分类群。在 Fusarium 组中，一些分离物表现出与 Fusarium oxysporum 和 Fusarium solani 一致的形态特征，而其他分离物只能归属于 Fusarium spp.。在 Aspergillus 组中，分离物与 A. niger、A. fumigatus、A. flavus 和 A. parasiticus 形态一致。Rhizoctonia solani 和 Macrophomina phaseolina 根据其培养和形态特征进行区分，Alternaria 分离物被推定归属于 Alternaria alternata。Penicillium、Rhizopus、Trichoderma 和 Chaetomium 的分离物无法可靠地解析到物种水平，因此保留属级鉴定。检测到的真菌分类群与埃塞俄比亚及其他地区菜豆种子上报告的类群一致，但一些先前研究中报告的类群如 Phoma spp.、Cladosporium spp.、Botrytis spp.、Ascochyta spp.、A. ochraceus 和 Sclerotium rolfsii 在本研究中未被检测到，这种差异可能与环境条件、贮藏实践、寄主基因型、地理位置、采样和方法途径的差异有关。

3.4 贮藏菜豆种子中分离的真菌属数量和种传真菌物种的相对频率

真菌学分析揭示了九个种子相关真菌属的存在：Aspergillus、Fusarium、Penicillium、Alternaria、Macrophomina、Rhizoctonia、Rhizopus、Trichoderma 和 Chaetomium。总体而言，Fusarium（385株分离物）和 Aspergillus（346株）是研究区域中最常分离的属，其次是 Alternaria（164株）、Macrophomina（85株）和 Rhizoctonia（77株）。最不常分离的属是 Rhizopus（25株）和 Chaetomium（34株）。在检测到的真菌属中，Fusarium spp. 的总体相对频率最高（16.8%），其次是 Alternaria（推定 A. alternata 组；12.9%）、Penicillium spp.（6.8%）、Macrophomina（推定 M. phaseolina 组；6.7%）、Trichoderma spp.（5.8%）和 Rhizoctonia（推定 R. solani 组；5.4%）。Aspergillus spp. 作为属级类别，相对频率为4.3%，而推定形态组 A. niger、A. fumigatus、A. flavus 和 A. parasiticus 分别占11.0%、4.7%、4.0%和3.2%。Rhizopus spp. 和 Chaetomium spp. 是最不常检测到的类群，总体相对频率分别为2.0%和2.7%。Aspergillus 和 Fusarium 中某些物种能够在有利的环境和贮藏条件下产生真菌毒素，其存在值得特别关注。在各地理区域中，古巴科里查记录了最高的总体真菌载量，特别是Nasir品种（194株分离物），其次是Awash-1（153株）和Awash-2（150株）。相比之下，安查尔和奇罗地区观察到较低的真菌数量。这种空间变异可能与贮藏实践、环境条件（特别是温度和相对湿度）、种子水分含量和采前污染水平的差异有关。

3.5 贮藏菜豆品种中分离的真菌分类群的频率和分布

贮藏菜豆种子样品中真菌分类群的发生频率范围为20.0%至100.0%。推定 Alternaria alternata 组是分布最广的类群，出现在86.7%的45份种子样品中。Fusarium spp. 是第二分布最广的属，出现在75.6%（34/45）的种子样品中。在 Fusarium 组内，推定 F. oxysporum 组总体出现在66.7%的样品中，地区频率为安查尔60.0%、奇罗66.7%和古巴科里查73.3%。推定 F. solani 组总体出现在57.8%的样品中。Aspergillus 属表现出相当的形态多样性，推定 A. niger 组的总体发生率最高（75.6%），其次是 A. flavus（51.1%）、A. fumigatus（48.9%）、Aspergillus spp.（48.9%）和 A. parasiticus（33.3%）。Penicillium spp. 在60.0%的样品中被检测到。推定 Macrophomina phaseolina 组总体出现在48.9%的样品中，推定 Rhizoctonia solani 组在48.9%的样品中被检测到。Trichoderma spp. 总体出现在60.0%的样品中，而 Rhizopus spp. 和 Chaetomium spp. 分别出现在35.5%和20.0%的样品中。频率和分布模式在不同菜豆品种间也有变化，表明真菌发生可能受品种特性、地点、环境条件、种子质量和贮藏实践之间相互作用的影响。

3.6 贮藏菜豆种子中分离的单个真菌分类群的发病率

从贮藏菜豆种子中回收的真菌分类群的发病率在不同地区和品种间有所变化。方差分析表明，在评估的真菌分类群的发病率中，地区、品种或其交互作用之间没有统计学显著差异，包括 Aspergillus spp.、推定 A. niger、A. flavus、A. fumigatus、Fusarium spp.、推定 F. oxysporum 和 F. solani、Penicillium spp.、推定 Alternaria alternata、Rhizoctonia spp.、Rhizopus spp. 和 Trichoderma spp.。在推定物种级类群中，F. solani 组的最高平均发病率记录在古巴科里查（8.8%），其次是奇罗（7.2%）和安查尔（5.9%）。Penicillium spp. 表现出相对较低的发病率。

3.7 菜豆品种和地区间种子相关真菌分类群的变异

方差分析显示，地区和品种的主效应及其交互作用对贮藏菜豆种子中推定 Aspergillus parasiticus 的发病率有高度显著影响（p < 0.001）。最高发病率记录在来自奇罗地区的Nasir品种中（8.8%）。对于 Fusarium spp.，地区效应显著（p < 0.01），地区×品种交互作用显著（p < 0.05）。Fusarium spp. 的最低发病率记录在来自安查尔地区的Awash-2种子中（2.0%），而最高发病率出现在来自古巴科里查的Nasir种子中（18.8%）。对于推定 Fusarium solani，地区、品种及其交互作用显著影响其发病率（p < 0.05），最高发病率记录在来自奇罗地区的Awash-1种子中（7.2%）。对于推定 Macrophomina phaseolina，地区×品种交互作用显著（p < 0.05），表明观察到的发病率在特定的地区和品种组合间存在差异。

3.8 种传真菌对种子萌发的影响

种子萌发试验显示贮藏菜豆种子的萌发率范围为54%至100%。方差分析表明，种子萌发受地区、品种及其交互作用的显著影响（p < 0.001）。来自古巴科里查地区的Nasir品种种子表现出显著最低的萌发率（p < 0.05），平均值为57%，范围为45%至95%。相比之下，最高萌发率（95%；范围90%–100%）记录在来自古巴科里查地区的Awash-2品种中，其次是来自安查尔地区的Awash-2（94%）和来自安查尔地区的Nasir（94%）。总体而言，较高的真菌感染水平与降低的种子萌发相关，表明种传真菌载量与贮藏菜豆种子活力之间存在明确的负相关关系。

3.9 水分含量、种传真菌属发病率和贮藏菜豆种子萌发率之间的相关性

Pearson相关性分析揭示了水分含量、总真菌感染、萌发率与单个种传真菌属发病率之间的几个显著关联。水分含量与总真菌感染呈强正相关（r = 0.815），表明水分含量较高的样品往往具有较高的真菌感染水平。水分含量与萌发率呈负相关（r = ?0.314，p < 0.05），表明水分含量较高的样品往往萌发率较低。总真菌感染与萌发率呈负相关（r = ?0.464，p < 0.01），表明真菌感染水平较高的样品往往萌发率较低。在单个真菌属中，Rhizoctonia 与萌发率呈强负相关（r = ?0.659，p < 0.01），并与水分含量（r = 0.357，p < 0.05）和总真菌感染（r = 0.499，p < 0.01）呈正相关。Fusarium 属与水分含量（r = 0.412，p < 0.01）和总真菌感染（r = 0.396，p < 0.01）呈显著正相关，但与萌发率的相关性较弱且不显著（r = ?0.114）。Rhizopus 与总真菌感染呈显著正相关（r = 0.456，p < 0.01）。相比之下，Penicillium、Alternaria、Trichoderma 和 Chaetomium 与水分含量、总真菌感染或萌发率没有显著相关性。

3.10 致病性真菌分离物的人工接种和症状诱导试验

单因素方差分析显示，真菌分离物在菜豆幼苗（墨西哥142品种）上的致病性（以病情严重度指数PSI和病害发生率DI表示）之间存在高度显著差异（p < 0.001）。所有四种测试真菌 Macrophomina phaseolina、Rhizoctonia solani、Fusarium oxysporum 和 Alternaria alternata 均诱导了根腐病症状，但其致病力差异显著。M. phaseolina 和 R. solani 是最具攻击性的病原体，分别产生最高PSI值97.22%和94.44%。所有真菌处理的PSI值均显著高于未接种对照（11%）。同样，所有接种处理的DI（60%–100%）显著高于对照（0%–40%）。其中，R. solani 引起最高DI（95%；范围80%–100%），显著高于 A. alternata（74%）。M. phaseolina 和 F. oxysporum 各表现出85%的中间发病率水平。在感病菜豆品种墨西哥142上的症状诱导试验确认了所有分离物的致病特征，典型症状包括坏死病变、红至深褐色变色、茎缢缩和根腐。R. solani 引起严重的幼苗猝倒病。

四、讨论与结论

研究讨论部分指出，检测到的真菌属的多样性与其他地区报告的菜豆种子相关真菌一致。Fusarium、Alternaria、Aspergillus 和 Penicillium 的优势性与先前关于菜豆和其他贮藏豆类种子相关真菌的报告广泛一致。Aspergillus 和 Fusarium 的发生尤为重要，因为某些物种能够在有利的环境和贮藏条件下产生真菌毒素。然而，研究中检测到这些属并不本身确立特定产毒物种或真菌毒素的存在，需要分子表征和直接真菌毒素分析来建立这些关系。不同地区和品种间观察到的真菌频率差异可能与环境条件、作物生产实践、采前污染、收获和采后处理、贮藏条件、种子水分和贮藏时间的差异有关。研究还强调，Rhizoctonia solani 作为菜豆病原体，与种子腐烂、萌发前猝倒和萌发后猝倒相关，这为观察到的 Rhizoctonia 发病率与较低萌发之间的关联提供了生物学解释。

研究结论部分指出，在西哈勒尔盖地区选定地区的贮藏菜豆种子中，以 Fusarium、Aspergillus 和 Alternaria 为主的多种种传真菌与之密切相关。这种污染对种子活力和幼苗健康均产生不利影响。研究共分离出9个真菌属、15个真菌种，平均种子感染率为56.3%。Alternaria alternata 是最广泛分布的真菌类群，Fusarium 属在分离物数量上最为优势。致病性试验确认 Macrophomina phaseolina、Rhizoctonia solani、Fusarium oxysporum 和 Alternaria alternata 均能诱导根腐病症状，其中 Rhizoctonia 表现出最高致病力。这些发现强调了改进种子贮藏实践和制定有效的、针对特定地点的病害管理策略的迫切需求。未来研究应纳入分子工具进行物种鉴定，以确认分类学准确性并评估贮藏种子中关键真菌病原体的遗传多样性，从而保障作物品质。