寨卡病毒蛋白提取物免疫诱导的交叉反应性中和抗体对登革病毒血清型的差异性中和作用

《Biotechnology Journal》：Cross-Reactive Neutralizing Antibodies Between ZIKV and DENV May Exhibit Serotype Specificity

　　

登革病毒（Dengue virus, DENV）和寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）是公共卫生威胁，在全球范围内造成大量发病和死亡。DENV与ZIKV的共同流行使防控工作复杂化，凸显了研究交叉反应性抗体、疫苗及免疫调节剂的重要性。本研究探讨了经ZIKV蛋白提取物免疫所诱发的针对DENV的抗体的交叉反应性及中和能力。研究人员以ZIKV蛋白提取物免疫雌性同系BALB/c小鼠，该提取物源自C6/36细胞培养物。采用聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）将免疫小鼠脾脏B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，生成杂交瘤细胞。通过酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）和蚀斑减少中和试验（plaque reduction neutralization test, PRNT）评估所得抗体对ZIKV和DENV及其结构和非结构蛋白的反应性。研究结果显示，免疫诱导产生了多样化的抗体应答，包括识别ZIKV独有表位以及ZIKV与DENV共有表位的抗体。值得注意的是，靶向保守表位（尤其是与DENV-1共有的表位）的中和抗体同样可中和其他DENV血清型。这些结果表明，ZIKV与DENV之间存在交叉反应性中和抗体应答，且可能具有血清型特异性反应特征。综上，本研究为黄病毒交叉反应性提供了实验证据，有助于更深入地理解这些病毒共同流行地区体液免疫应答的特征。

论文解读：寨卡病毒与登革病毒交叉反应性中和抗体的血清型特异性研究

一、研究背景与科学问题

登革病毒（Dengue virus, DENV）和寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）均属于黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属（Orthoflavivirus），通过伊蚊属（Aedes spp.）蚊虫传播，是全球重要的公共卫生威胁。两种病毒基因组序列相似度约为55%–58%，共编码十种蛋白质，包括衣壳蛋白（C）、前膜蛋白（prM）、包膜蛋白（E）及五种非结构蛋白（NS1–NS5）。DENV每年估计导致4亿人感染，主要分布于热带和亚热带地区，重症可表现为出血热和休克综合征；ZIKV感染虽多无症状或症状轻微，但可导致成人格林-巴利综合征及胎儿小头畸形等先天性异常。2013–2014年太平洋岛屿及2015年巴西的暴发疫情充分体现了两种病毒地理共同流行的严峻现实。

两种黄病毒的共同流行给精准诊断和有效防治带来重大挑战。黄病毒间的交叉反应性虽使诊断复杂化，却为免疫治疗提供了潜在机遇。单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）疗法自20世纪80年代起被广泛应用，可弥补传统治疗在药物毒性、耐药性和疗效方面的局限。然而，DENV疫苗（如Dengvaxia）的临床应用揭示了抗体依赖性增强（antibody-dependent enhancement, ADE）效应——既往DENV感染可能加重再次感染的疾病严重程度。因此，深入理解ZIKV与DENV之间的交叉反应性免疫应答，对于疫苗研发、免疫治疗策略制定及共同流行地区的疾病防控具有重要意义。

在此背景下，本研究旨在探讨ZIKV蛋白提取物免疫所诱发的抗ZIKV抗体对ZIKV和DENV的交叉反应潜力及中和能力，为黄病毒共同流行地区的免疫应答特征提供实验证据，并为免疫治疗的潜在适用性提供初步见解。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员采用以下关键技术方法开展研究：以ZIKV（H/PF/2013株）感染白纹伊蚊（Aedes albopictus）C6/36细胞制备病毒蛋白提取物，免疫雌性同系BALB/c小鼠（N=5），每只小鼠经腹腔注射3剂含10 μg抗原及180 μg氢氧化铝佐剂的免疫方案。免疫后约5天取小鼠脾脏分离B淋巴细胞，采用聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）与SP2骨髓瘤细胞融合生成杂交瘤，共获得96个杂交瘤并组织为10个杂交瘤组（Poly 1–10）。通过有限稀释法进行克隆，获得单克隆抗体。抗体经亲和层析纯化后，采用间接酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）、捕获ELISA、蛋白质印迹（Western blot）及蚀斑减少中和试验（plaque reduction neutralization test, PRNT）系统评估抗体对ZIKV和DENV四种血清型（DENV-1至DENV-4）的反应性与中和能力。此外，还制备了重组蛋白Multi-ZIKV、Multi-DENV（含NS1蛋白第57–126位氨基酸多抗原决定簇区域）、E2和E6蛋白（分别对应ZIKV多聚蛋白第108–2489位和第413–2489位基因组区域）用于表位特异性分析。

三、研究结果

3.1 抗体产生与稳定性

免疫后小鼠血清经ELISA确认抗体产生。96个杂交瘤被组织为10个杂交瘤组（Poly 1–10），其抗体生产能力在12个月以上保持稳定，且经细胞冷冻保存、复苏及不同批次抗原处理后仍维持稳定。克隆前抗体被视为多克隆抗体，克隆后为单克隆抗体。

3.2 ELISA检测结果

ELISA检测中，杂交瘤产生抗体的OD值范围为0.3–1.8（阳性对照=2.0，阴性对照=0.10）。捕获ELISA确认了所产抗体的特异性，OD值范围为1.44–2.21，其中Poly 6和Poly 8分别为1.85和2.21，商品化抗黄病毒抗体（D14G2415, ATCC HB112）为3.02，未感染ZIKV和DENV个体血清池（阴性对照）为0.26。使用Vero细胞中产生的ZIKV进行ELISA验证，Poly 6和Poly 8的OD值分别为2.12和1.98，排除了C6/36细胞成分的干扰。基于持续12个月以上的稳定抗体生产能力及较低浓度下中和ZIKV的能力，Poly 6和Poly 8被选择进行克隆。ELISA结果显示，Poly 6、Poly 8及其单克隆克隆对ZIKV蛋白提取物的OD值比对DENV蛋白提取物高2–4倍，表明其ZIKV特异性，同时与DENV存在交叉反应。

3.3 ZIKV中和活性

PRNT检测显示，Poly 1–10对ZIKV的中和能力存在差异。其中Poly 3、6、7和8表现出较显著的中和活性。Poly 6在1000 μg/mL时中和率为87%，Poly 8在1000 μg/mL时为68%。Poly 6和Poly 8因在1000–125 μg/mL浓度区间具有优势中和能力而被选为克隆来源。其单克隆克隆大多保留了中和活性，其中P61B8、P62D8（源自Poly 6）及P81B5、P81D5、P82F6（源自Poly 8）表现出中和能力。

3.4 对DENV血清型的交叉中和活性

中和活性最高的单克隆抗体进一步评估了对DENV的中和能力。所有检测的抗ZIKV单克隆抗体均能中和DENV-1，但无一表现出对DENV-4的中和活性。其中，P62D8和P82F6能中和四种DENV血清型中的两种，而P81D5能中和三种，显示出更广谱的交叉中和潜力。具体而言，P61B8的半数抑制浓度（IC50）为15.6 μg/mL（DENV-1和DENV-3）；P62D8的IC50为62.5 μg/mL（DENV-1）和31.3 μg/mL（DENV-2）；P81D5的IC50为15.6 μg/mL（DENV-1）及7.8 μg/mL（DENV-2和DENV-3）；P82F6的IC50为7.8 μg/mL（DENV-1和DENV-3）及500 μg/mL（DENV-2）。

3.5 Western blot表位分析

Western blot结果显示，Poly 2、3、4、5和7未识别ZIKV蛋白提取物或任何检测的重组蛋白，其中Poly 2和Poly 5特异性识别DENV蛋白提取物中约100–75 kDa的蛋白。Poly 6和Poly 8可检测ZIKV蛋白提取物中的线性表位（100–75 kDa），但不识别DENV蛋白提取物；它们不识别EDIII_ZK抗原，但能结合重组蛋白E2和/或E6。其单克隆衍生物P61B8、P61C3、P62C11、P81B5、P81D5和P82F6对E2抗原具有特异性。所有检测抗体均未识别Multi-ZIKV、Multi-DENV、NS1_ZK、NS1_D1、NS1_D2或EDIII_ZK蛋白，表明这些抗体靶向的线性表位存在于E2和E6等特定重组蛋白中。

四、讨论与结论

研究人员发现，ZIKV蛋白提取物免疫诱导的多克隆抗体应答产生了多样化抗体，包括能区分ZIKV和DENV株间线性与构象表位的抗体，以及具有病毒中和活性的交叉反应性抗体。在ZIKV与DENV共同流行地区，反复感染不同DENV血清型使交叉反应性的解读复杂化。研究结果支持交叉反应性可能源于ZIKV特异性抗体也能识别DENV表位的假说。

ZIKV与DENV之间的高结构同源性导致共享氨基酸序列和抗原表位，从而产生交叉反应性免疫应答。E蛋白结构域中，EDI和EDII与ZIKV和DENV之间的交叉反应性相关，而EDIII倾向于诱导血清型特异性应答。大多数强效中和抗体靶向黄病毒粒子表面的构象表位，但线性表位也能刺激中和抗体产生。本研究结果表明ZIKV蛋白提取物诱导的抗体同时识别构象和线性表位。

抗体与抗原的结合涉及静电作用、氢键、范德华力和疏水相互作用等多种非共价可逆结合。免疫复合物的稳定性受抗体亲和力（解离常数Kd）和浓度影响。Vero细胞表面不表达Fcγ受体，支持高抗体浓度下观察到的阴性中和值不太可能由经典Fcγ受体介导的ADE机制所致。

既往研究多关注DENV免疫对ZIKV感染的影响，而较少探讨反向关系。本研究结果与Watanabe等（2018）的发现一致，表明ZIKV感染可诱导靶向特定DENV血清型的交叉反应性中和抗体，但交叉反应性可能因血清型及中和与非中和应答的优劣而异。Larocca等（2021）报告减毒DENV疫苗在小鼠和恒河猴模型中未诱导出针对ZIKV的交叉反应性中和抗体，这种矛盾结果可能源于实验模型、抗原决定簇和免疫应答模式的差异。

研究结论指出，ZIKV蛋白提取物免疫可诱导产生识别与DENV血清型（尤其是DENV-1）共享表位的中和抗体。这些发现提示ZIKV与DENV之间存在交叉反应性中和抗体应答，且可能具有血清型偏向性。本研究为黄病毒交叉反应性提供了实验证据，有助于更深入地理解这些病毒共同流行地区的体液免疫应答特征，并为免疫治疗的潜在应用提供了初步见解。