面向高通量连续培养的模块化微恒化器系统及其在酵母系统生物学中的应用

《Biotechnology and Bioengineering》：A Modular Micro-Chemostat System for High-Throughput Continuous Cultivations

　　

：提升真核计算模型的保真度将需要大量来自生物学实验的高质量且可重复的数据。本研究展示了一套模块化12通道微恒化器系统。该微恒化器专为Genesis设计使用，Genesis是为实现酵母系统生物学研究自动化而开发的机器人科学家（Robot Scientist）。研究人员进行了生物反应器表征实验，以评估微恒化器系统的性能。研究人员还在三种不同稀释率（dilution rate，D）（0.1、0.2和0.3 h?1）以及两种通气条件（微好氧和好氧）下培养了酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）参考菌株BY4741，共形成六种不同条件。生物反应器的性能满足了设计要求，并实现了酵母的底物限制连续培养。此外，生物学实验得到的经验结果与文献报道一致，表明从该系统获得的结果与该领域其他平台报道的结果具有可比性。基于本研究中呈现的证据，研究人员得出结论：12通道微恒化器系统是适用于酵母系统生物学研究的平台。该微恒化器系统的模块化设计使其未来可扩展至数百甚至数千个并行恒化器，并有助于与自主智能体（autonomous agents）集成，实现真核模型系统的自动化优化与改进。

论文解读文章

一、研究背景与问题

系统生物学旨在通过构建和分析生物系统的数学模型，研究复杂大分子相互作用所涌现的行为。然而，构建和验证计算模型需要大量可重复的、假设驱动的实验数据。以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为代表的模式生物，经过数十年研究已积累了丰富的基础设施，如Saccharomyces基因组数据库和全基因组缺失株文库等。但由于该生物已被充分研究，单个生物学实验对模型改进的预期贡献很小，实验成本难以合理化，而基因组中大量基因的功能仍待阐明。因此，推动酵母系统生物学发展必须通过实验室自动化和高通量方法降低实验的经济和人力成本。

机器人科学家（Robot Scientist）将自动化实验平台与AI驱动的科学探究相结合，以提高生物学实验的速度和质量。此前开发的机器人科学家Adam和Eve分别用于功能基因组学和自动化药物开发。Genesis是正在开发的新一代机器人科学家，旨在实现酵母系统生物学领域科学研究的闭环自动化。其总体目标是建立自主循环流程：AI智能体基于公开知识生成关于酵母未报道现象的假设，将假设转化为可定量验证的预测，生成人机可读的本体论协议并存储于实验数据库，随后自主执行实验并分析结果，最后根据结果修订生物模型。研究人员估计，Genesis需要数百甚至数千个并行实验才能匹配AI驱动假设生成和验证的潜在速度。

现有高通量生物反应器大多仅支持批式和补料分批培养。细胞群体本质上是动态系统，对初始条件和取样方案高度敏感，微小的实验变异会累积为显著随机变异，损害研究的可解释性和可重复性。恒化器（chemostat）培养是一种连续培养技术，通过营养限制和恒定稀释实现细胞稳态生长。理论上，当生长函数单调时，恒化器系统收敛于单一全局稳态，消除了严格取样方案的需求，结果受初始条件微小变异的影响也较小。此外，恒化器可控制生物量比生长速率，使研究者能观察生物在不同生理情境下的行为。尽管已有多种小型和微型恒化器被构建，但其可扩展性不足以支撑每周数百次实验的高通量需求，且均未以实验室自动化为设计目标。因此，为支撑Genesis的研究速度，需要一种可自动化、高通量的恒化器系统。

二、研究内容与结论

本研究呈现并验证了一套模块化12通道微恒化器系统，专为高通量生物学实验设计。其紧凑密封的结构允许通过并行运行多个微恒化器系统来增加并行实验数量；控制方案支持远程访问，使单个AI智能体能够同时协调多个系统。研究人员通过验证流速线性、稀释率、温度和通气等反应器参数评估了系统性能，并在三种稀释率（0.1、0.2和0.3 h^?1）和两种通气条件（微好氧和好氧）下进行了多次生物学实验。

研究发现微恒化器性能符合设计要求，反应器参数变异在规定的容差范围内。反应器间温度和稀释率的变异足够小，可预期开展可信的生物学实验。生物学实验结果与文献一致，表明可在Genesis微恒化器单元中进行酿酒酵母实验。该系统是用于酵母高通量连续培养的有前景平台，可用于生成酵母系统生物学研究数据。

三、关键技术方法

该系统由四个互联模块组成，通过CAN总线通信：流体模块、电机模块、板模块和控制模块。培养在灭菌的48深孔板中进行，孔作为独立生物反应器，工作体积约1.5 mL，其中12个孔可用。流体模块包含培养容器顶部、泵、阀和管路，以及顶空气体加湿系统。电机模块包含10个NEMA-17电机，通过定制Oldham联轴器驱动泵和阀。板模块包含升降平台，负责定位、加热和搅拌反应板，并配有HEPA过滤风扇以维持正压降低污染风险。连续培养通过输入泵持续流入培养基和 effluent泵持续流出细胞液实现。稀释率由输入泵流速决定。反应器从底部通过bang-bang控制加热器加热，从侧面通过包裹式加热器加热，通过磁力搅拌器搅拌。加湿热空气由单通道正排量气泵输送，空气阀实现12条气线的顺序加压以清除冷凝水。反应器参数表征方法包括：用红色食用染料测定稀释率与泵转速关系及流速线性；用牛顿冷却定律拟合估算反应器内温度；用亚硫酸盐氧化法测定体积传质系数（k_La）。生物学实验中，酿酒酵母BY4741菌株取自EUROSCARF酵母缺失株文库，在改良Verduyn培养基中进行葡萄糖限制连续培养，运行10个保留时间后取样进行光密度（OD）测定和高效液相色谱（HPLC）分析。

四、研究结果

反应器表征：流速与泵转速呈线性关系，转换因子为0.093 mL h^?1 rpm^?1。反应板各生物反应器间稀释率变异系数为2.24%。温度变异系数为1.01%，与设定温度（30°C）的最大偏差为0.3°C。标准操作条件下通过亚硫酸盐氧化法测得k_La为19 h^?1。无菌对照实验运行10个保留时间后，OD处于检测下限，显微镜和YPD琼脂平板培养均未检出微生物，表明污染风险较低。

生理参数——微好氧培养：在微好氧条件下（不额外供气，培养基添加麦角固醇和Tween80，葡萄糖浓度2 g L^?1），培养10个保留时间后，估算生物量浓度随稀释率增加而降低。HPLC分析显示，残余葡萄糖和发酵副产物（乙醇、乙酸）在高稀释率（D=0.3 h^?1）时升高。生物量对底物得率随稀释率增加而下降，而副产物对底物得率随稀释率增加而上升，其中乙醇得率增加显著。所有培养中均观察到少量乙酸产生（0.02–0.06 g L^?1），并随稀释率增加而升高。甘油仅在D=0.3时检出。

生理参数——好氧培养：在好氧条件下（供气，k_La约4.54 mmol O₂ L^?1 h^?1，葡萄糖浓度1 g L^?1），估算生物量同样随稀释率增加而降低。残余葡萄糖和副产物浓度在较高稀释率下略有升高，但明显低于微好氧条件，表明好氧条件下细胞更高效地将葡萄糖转化为生物量。好氧条件下生物量对葡萄糖得率显著高于微好氧条件，这可能是由于Crabtree效应：酿酒酵母在高稀释率下从ATP效率更高的有氧呼吸转变为更快但效率较低的发酵。乙醇得率在好氧条件下随稀释率升高而增加，但在最高稀释率0.3 h^?1时略低于0.2 h^?1；然而乙醇对生物量得率在0.2和0.3 h^?1时相近，表明单位细胞的乙醇产量相似。

碳平衡分析：碳回收率介于0.70–0.88之间，未达到理想水平。大部分缺失碳可能以二氧化碳形式存在，因本版本微恒化器未安装CO₂传感器而未被测量。微好氧条件下碳回收率不随稀释率变化，而好氧条件下碳回收率随稀释率增加而降低，表明好氧条件下代谢受生长速率影响显著，可能与Crabtree效应导致的CO₂和其他副产物增加有关。

五、讨论与结论

讨论部分指出，反应器参数满足应用需求：稀释率变异系数2.24%低于此前研究报道的3%–5%；温度变异系数1.01%；k_La为19 h^?1，与文献报道的14.4 h^?1相当。好氧条件下D=0.1 h^?1时最大生物量对葡萄糖得率为0.50 C-mol/C-mol，与文献值0.49 C-mol/C-mol一致。高稀释率下生物量浓度下降、残余葡萄糖升高的现象也与文献一致。但每个实验条件仅执行一次，需重复实验以评估系统可重复性。

当前版本存在一些局限：反应器内无在线溶解氧（DO）、pH和OD测量，因反应器截面小且底部有磁力搅拌子而无法安装探针或传感器点；k_La相对于工业搅拌罐（STR）生物反应器较低（工业STR为100–300 h^?1），无法支撑好氧高密度培养；亚硫酸盐氧化法可能高估k_La值，但本研究中仅需估算以调整培养基葡萄糖浓度，好氧与微好氧培养的生理差异表明好氧培养未受氧限制。小反应器体积带来取样挑战：OD和HPLC分析所需样品量占工作体积的相当比例，直接从培养物取样会破坏稳态，而从effluent通道取样在低稀释率下需约5小时才能收集足够样品。未来改进方向包括：开发需更小体积的分析方法、指数增加工作体积的取样方案、安装在线OD传感器、DO和pH传感器点、连接CO₂传感器以完善碳平衡分析、开发48通道泵将每单元培养通道数从12增至48、以及将本体论实验数据库与系统完全集成以实现AI智能体控制。

研究结论为：研究人员呈现并验证了一套模块化12通道微恒化器系统，该系统专为支持闭环自动化真核模型改进的高通量培养实验而设计。生物反应器性能满足预定要求。在微恒化器中于不同条件下培养酿酒酵母参考菌株BY4741，获得的经验结果与文献一致。因此，12通道微恒化器系统适用于酵母系统生物学研究。未来该微恒化器实验室将扩展至数百或数千个并行高通量恒化器，以实现真核模型的大规模自动化改进。