《Transboundary and Emerging Diseases》：Development of a Gag-Based Indirect ELISA and Its Application for Serological Surveillance of Antibodies Against Small Ruminant Lentiviruses (SRLVs)
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小反刍兽疫病毒（SRLVs）在绵羊和山羊中引起终身持续感染，损害生产力并限制牲畜贸易。血清学酶联免疫吸附试验（ELISA）检测是SRLV流行病学监测的主要方法，多数商业ELISA以衣壳蛋白（CA）、包膜蛋白或二者组合作为抗原。研究人员此前建立了一种基于CA的间
小反刍兽疫病毒（SRLVs）在绵羊和山羊中引起终身持续感染，损害生产力并限制牲畜贸易。血清学酶联免疫吸附试验（ELISA）检测是SRLV流行病学监测的主要方法，多数商业ELISA以衣壳蛋白（CA）、包膜蛋白或二者组合作为抗原。研究人员此前建立了一种基于CA的间接ELISA（iELISA）用于检测SRLV抗体。本研究表达了全长重组SRLV Gag蛋白，并进一步建立了以Gag为包被抗原的iELISA。基于100份SRLV阴性血清的样品与阳性对照比值（S/P ratio）分析，确定所建立的Gag-iELISA的临界值为0.093。使用Gag-iELISA、CA-iELISA和一种商业ELISA对228份血清进行平行检测，结果显示Gag-iELISA的阳性检出率比CA-iELISA高35.96个百分点，比商业ELISA高4.39个百分点。所有经CA-iELISA或商业ELISA检测为阳性的样本，其Gag-iELISA检测结果均为阳性。经Gag-iELISA检测为阳性但CA-iELISA或商业ELISA检测为阴性的样本，通过蛋白印迹（WB）确认为SRLV抗体阳性。Gag-iELISA与商业ELISA的一致性分析显示总体符合率为95.61%。终点稀释实验表明，Gag-iELISA的分析灵敏度是CA-iELISA的2倍，并与商业ELISA相当。此外，对2024–2025年间采集自呼伦贝尔的761份绵羊血清进行检测，结果显示SRLV血清阳性率总体为54.80%，各地区阳性率范围为0.00%至84.44%。综上所述，所建立的Gag-iELISA是一种灵敏且实用的大规模SRLV血清学监测工具。
小反刍兽疫病毒（SRLVs）是一类引起绵羊和山羊终身持续感染的慢病毒，具有高度遗传多样性，广泛流行于全球多个国家和地区。SRLV感染可导致动物多器官慢性炎症病变，造成乳产量下降、繁殖性能降低、生长迟缓及提前淘汰等严重经济损失，同时限制国际活畜贸易。目前尚无有效疫苗可用，严格的诊断筛查是控制疫情和净化畜群的最有效策略。世界动物卫生组织（WOAH）推荐的琼脂凝胶免疫扩散试验（AGID）因灵敏度不足且结果判读主观性强，已逐渐被酶联免疫吸附试验（ELISA）取代。当前商业和实验室自建的抗体检测试剂大多采用间接ELISA（iELISA）形式，包被抗原以衣壳蛋白（CA）单独使用或CA与包膜（Env）衍生肽联用为主。然而，中国市场上缺乏低成本商业ELISA试剂盒，且现有商品化试剂盒对国内流行株的诊断灵敏度存在局限。研究人员此前已建立了基于CA蛋白的iELISA，但其阳性检出率低于商业SRLV ELISA。为提高SRLV血清学检测灵敏度，本研究利用在中国分离的SRLV A2亚型毒株全长Gag蛋白作为包被抗原，建立了新型Gag-iELISA，并对中国部分地区进行了血清学流行病学调查。本研究的意义在于提供一种灵敏度高、成本可控且适合大规模筛查的SRLV血清学检测工具，为国内SRLV的流行病学监测与防控提供技术支持。经系统优化与评估，研究人员成功建立了性能优良的Gag-iELISA，并在呼伦贝尔地区的现场样本检测中验证了其实用价值。
研究人员开展了以下主要工作：首先，将来源于新疆分离株（GenBank登录号MZ313871.1，SRLV A2亚型）的全长Gag基因克隆至pET30a(+)载体，转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达获得可溶性重组Gag蛋白（rGag），并通过镍离子亲和层析纯化。同时，研究人员还构建了另外两株中国分离株（KT214469.1和MW248464.1）的全长Gag表达质粒，经表达水平比较后选择表达量最高的MZ313871.1来源Gag作为检测抗原。以纯化的rGag为包被抗原，通过方阵滴定法优化了抗原包被量、血清稀释度、二抗稀释度、封闭条件、孵育时间及底物显色时间等关键参数，建立了Gag-iELISA。以100份SRLV阴性血清确定临界值。参考血清分别来自经商业ELISA（ID.Vet, CVT1135T）、CA-iELISA和蛋白印迹（WB）验证的SRLV阴性及阳性样本。随后，研究人员对方法的特异性、重复性和灵敏度进行了系统评估，并与CA-iELISA及商业ELISA进行了对比分析，包括228份田间血清的平行检测和3份不同反应强度阳性血清的终点稀释实验。最后，应用该Gag-iELISA对2024–2025年间采集自内蒙古自治区呼伦贝尔市13个旗县区的761份绵羊血清及来自新疆、青海、云南和福建4个省份的325份血清（源自前期建立的血清库）进行了检测，以评估其现场应用效果并调查区域SRLV血清阳性率。
3.1 rGag表达与纯化：成功表达并纯化了分子量约为55 kDa的组氨酸标记重组Gag蛋白（rGag）。SDS-PAGE分析确认目的蛋白得到有效纯化；WB结果显示rGag可与抗His抗体和SRLV阳性血清发生特异性反应，而不与SRLV阴性血清反应，表明其具有良好的抗原特异性。
3.2 Gag-iELISA的建立与优化：通过方阵滴定法确定最佳工作条件为：抗原包被量100 ng/孔、血清稀释度1:200、二抗稀释度1:5000。以5%脱脂奶粉37°C封闭60 min为最优封闭条件，血清最佳孵育时间为37°C 90 min，二抗最佳孵育时间为37°C 45 min，TMB底物最佳显色时间为7 min。
3.3 Gag-iELISA临界值的确定：利用100份经WB、CA-iELISA和商业ELISA确证的SRLV阴性血清进行统计分析，获得阴性血清S/P比值的平均值（M）为?0.000714，标准差（SD）为0.031238，按M+3SD计算确定临界值为0.093。S/P比值≥0.093判为阳性，<0.093判为阴性。
3.4 Gag-iELISA的特异性和重复性评价：对羊口蹄疫病毒A型和O型（FMDV-A、FMDV-O）、小反刍兽疫病毒（PPRV）、羊口疮病毒（ORFV）、绵羊痘病毒（SPPV）和羊种布鲁氏菌（B. melitensis）6种常见羊病阳性血清进行交叉反应检测，所有异源抗血清的S/P比值均远低于临界值，仅SRLV阳性对照血清呈明显阳性，表明该方法具有良好的分析特异性。重复性评估结果显示，板内变异系数（CV）范围为1.38%–2.38%，板间CV范围为1.95%–7.91%，表明该方法具有良好的重复性。
3.5 Gag-iELISA、CA-iELISA和商业ELISA的性能比较：对228份血清样品（160份绵羊、68份山羊）进行平行检测，Gag-iELISA检出阳性130份（57.02%），CA-iELISA检出48份（21.05%），商业ELISA检出120份（52.63%）。所有CA-iELISA或商业ELISA检测为阳性的样本在Gag-iELISA中均为阳性。对40份Gag-iELISA阳性而CA-iELISA和/或商业ELISA阴性的样本进行WB验证，结果全部为阳性，表明Gag-iELISA具有更低的假阴性率。对来自新疆、青海、云南和福建4个省份的325份血清库样本的检测结果显示，Gag-iELISA检出的阳性率分别为32.50%、27.06%、31.25%和28.75%，均显著高于此前CA-iELISA筛查的15.38%、7.40%、2.61%和9.54%。终点稀释实验显示，对于强阳性、中阳性和弱阳性3份参考血清，Gag-iELISA的终点滴度分别为1:12,800、1:1,600和1:400，与商业ELISA相当，均为CA-iELISA的2倍。一致性分析显示，Gag-iELISA与商业ELISA的总体符合率为95.61%（218/228），阳性符合率为100.00%（120/120），阴性符合率为90.74%（98/108），Cohen's kappa系数为0.912，表明两者具有几乎完全的一致性。
3.6 呼伦贝尔地区田间血清样本的SRLV抗体检测：应用所建立的Gag-iELISA对2024–2025年采集的761份绵羊血清进行检测，结果显示呼伦贝尔市13个旗县区的SRLV血清阳性率范围为0.00%至84.44%，总体血清阳性率为54.80%（417/761）。各地区阳性率差异较大，部分归因于样本量和采样覆盖范围的不同。
讨论部分指出，SRLV的高度遗传多样性是诊断面临的主要挑战。Gag蛋白作为群特异性抗原，其序列保守性显著高于Env，其中CA是病毒颗粒中最丰富的结构蛋白，也是感染早期最早被宿主免疫系统识别的抗原。然而，单一CA抗原因不同亚型间序列差异较大，可能导致信号偏弱或假阴性结果。全长Gag蛋白包含MA、CA和NC三个结构域，可捕获更广泛的宿主抗体谱，从而提高了检测灵敏度。研究还发现，虽然目前商品化ELISA多采用CA与Env表位组合抗原以覆盖不同感染阶段产生的抗体，但本研究中仅以全长Gag作为包被抗原的iELISA在分析灵敏度上已与多抗原商品化试剂盒相当，并在田间样本检测中表现出更高的阳性检出率。这可能与Gag蛋白中MA和NC结构域提供的额外抗原表位有关。研究结论为：研究人员成功建立了一种基于Gag蛋白的iELISA，用于绵羊和山羊血清中抗SRLV抗体的血清学检测，该方法具有优异的特异性、灵敏度和重复性。平行诊断比较证实，该方法的综合性能优于前期建立的CA-iELISA，并与使用CA及SU和TM衍生肽作为包被抗原的商品化ELISA相当或稍优。因此，该Gag-iELISA可作为SRLV大规模血清学筛查和流行病学监测的有力工具。
