编码多聚化禽甲型流感病毒 M2e 与 MHC-II 恒定链模体及泛 DR 表位融合的 mRNA 疫苗可赋予鸡针对 H9N2 病毒的保护力

《Vaccine》：mRNA vaccine encoding multimerized AIV-M2e fused to MHC-II invariant chain motif and Pan-DR epitope confers protection against H9N2 virus in chickens

　　

• 设计编码多聚化AIV-M2e的mRNA，将其与鸡MHC-II类分子恒定链（Ii）及PADRE辅助表位融合。• LNP-mRNA疫苗接种Ii-P-4×M2e诱导了Th1偏向性免疫反应以及局部和系统性抗体应答。• 抗M2e抗体表现出异亚型识别能力，并通过ADCC依赖的方式介导靶细胞杀伤。• 在接种的禽类中使用H9N2进行攻毒后，病毒排出和复制显著减少，同时维持了肺组织完整性。

引言

禽甲型流感病毒（AIV）仍然是全球家禽业的重大威胁，具有显著的流感大流行潜力，并对家禽的健康和可持续生产造成重大影响。自20世纪90年代以来，高致病性和低致病性AIV亚型的反复暴发和人畜共患溢出事件在全球家禽中引发了多次地方性流行病和大流行病，凸显了其重要的经济和公共卫生意义[1]，[2]，[3]。近期高致病性禽流感H5N1的暴发表明病毒持续发生动物向人类的传播，包括接触过感染动物或禽类的家禽场和奶牛场工人的感染[4]，[5]，[6]，[7]，[8]。

在家禽中，AIV感染主要与生长性能下降和产蛋量减少有关，导致重大经济损失，尤其是在并发感染的情况下[9]，[10]，[11]。AIV的持续抗原漂移和重配已产生了多个进化支系，能够感染多种宿主，包括家畜和人类，从而对疫苗有效性和长期疾病防控构成了重大挑战[12]，[13]，[14]，[15]。最新报告进一步强调了广泛的基因重配现象，促进了病毒的流行病学优势和适应性进化；例如，在新出现的禽源H7N9和H10N8病毒中鉴定出H9N2基因片段[16]，[17]，[18]，[19]。尽管取得了上述进展，目前针对AIV的现有控制和保护措施仍不足以阻止疾病传播和家禽群中反复发生的流行病。

目前获批许可的AIV疫苗主要靶向血凝素（HA），诱导针对高度可变HA1头部结构域的亚型特异性中和抗体。虽然对同株毒株有效，但这些疫苗提供的交叉保护有限，且往往无法降低对异源毒株的病毒排出[20]，[21]，[22]，[23]。另一方面，基于神经氨酸酶（NA）的疫苗虽能减轻疾病严重程度和病毒排出，但在商业家禽生产中尚不足以提供广泛的保护[24]，[25]，[26]。此外，传统的鸡蛋或细胞培养疫苗在大规模生产时仍然耗时且资源密集，限制了其对新兴流感病毒株的快速应对[27]。这些局限性使得需要发展提供针对抗原多样性AIV的更广泛且持久保护的替代疫苗接种策略。

一个有前景的靶标是流感病毒基质蛋白2胞外域（M2e），这是23个氨基酸的N端区域，在所有AIV亚型间高度保守[28]，[29]，[30]，[31]。由于其序列保守性和在感染细胞上的表达，M2e是开发通用疫苗的诱人候选靶标。然而，M2e特异性抗体通常不具有中和活性，其保护作用主要通过Fc依赖的机制介导，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）或吞噬作用[32]，[33]，[34]。多项研究已证明，通过类病毒颗粒（VLPs）、纳米颗粒或活载体平台递送的M2e可以诱导交叉反应性免疫并减轻哺乳动物和禽类宿主中的疾病严重程度[30]，[35]，[36]，[37]。然而，固有局限性，包括低免疫原性、低抗原丰度、亚最优抗原提呈和缺乏持续性抗体滴度，仍然是M2e疫苗的主要障碍[38]，[39]。

在之前的工作中，我们证明了生物工程化的食品级乳酸菌（LAB）载体通过黏膜途径递送四个串联重复的流感M2e（4xM2e），单独或与NA联合使用，可以诱导强烈的黏膜抗体应答（sIgA）[30]。然而，这种载体递送方式在诱导系统性抗体（IgY）应答方面的能力有限，因为它是专门针对黏膜给药设计的。这促使我们探索一种能够诱导平衡的局部和系统性免疫的替代平台。为此，随着基于mRNA的疫苗技术的快速发展，我们扩展了研究，以探索基于M2e的mRNA疫苗是否能增强家禽对AIV感染的免疫保护。虽然mRNA疫苗可以促进局部和系统性免疫应答，但每种应答的强度取决于疫苗的设计和递送方式。多项近期研究旨在利用主要表面糖蛋白，如禽流感血凝素（HA），以及内部蛋白如核蛋白（NP）作为mRNA疫苗靶标，在体液和细胞免疫两个臂中展示可测量的免疫应答，并在小鼠、雪貂和禽类等多种实验模型中对抗高致病性AIV（HP-AIV）攻毒提供保护[40]，[41]，[42]，[43]，[44]，[45]，[46]，[47]。尽管M2e特异性抗体通常不具有中和活性，但多个研究组最近报道了基于流感M2的mRNA疫苗可以诱导针对不同流感A病毒亚型的跨分支免疫[47]，[48]，[49]，[50]，[51]。

鉴于M2e序列较短，通过串联重复进行多聚化相较于单体构建体增强了免疫原性。然而，M2e疫苗的多聚化或佐剂化并不能完全防止鸡感染高致病性病毒；不过，它可以减轻疾病严重程度[36]，[37]，[52]。我们推测这些缺陷源于抗原提呈不足以及局部和系统性免疫应答的协调不佳。在本研究中，我们试图通过合成一种合理设计的mRNA构建体来增强多聚化M2e mRNA疫苗的免疫原性，该构建体编码4xM2e与鸡II类MHC恒定链基序（Ii，1–140 bp）和通用CD4+ T细胞表位（PADRE：AKFVAAWTLKAAA）的融合，以加强通过II类MHC的抗原提呈和辅助T细胞（Th细胞）的激活[53]，[54]，[55]，[56]，[57]，[58]，[59]。体外转录的编码4xM2e或Ii-P-4xM2e序列的mRNA被封装进标准脂质纳米颗粒（LNPs）中，这些LNP由1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷（DOTAP）、二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC）、胆固醇、PEG化脂质（DMG-PEG 2000）以及作为mRNA递送的可电离脂质Dlin-MC3-DMA组成。

在使用合成的mRNA优化体外蛋白表达后，我们通过肌肉注射（IM）和鼻腔注射（IN）途径评估了mRNA-LNP复合物在商品化鸡中的体内免疫保护潜力。mRNA-LNP疫苗接种引起了强烈的系统和黏膜免疫应答，IgY和sIgA产生增强，并有适度的T细胞激活。重要的是，接种的鸡在低致病性（LP）A/turkey/Wisconsin/1/1966（H9N2）病毒攻毒后，病毒排出显著减少，肺组织结构得以保存。这些发现证实了该mRNA疫苗的免疫原性和保护效力，支持其作为针对家禽AIV的安全、可扩展且广泛保护策略的潜力。

方法部分摘录

菌株、细胞系和病毒增殖

本研究中使用的所有细菌菌株、质粒、细胞系和病毒均列于附表S1中。T7线性模板载体（LTV）（Takara Bio Inc.，日本）为商业采购，用于目标基因序列的克隆以进行体外mRNA合成。大肠杆菌（E. coli）DH5α菌株（BioBharati LifeScience，印度）用于通过含有氨苄青霉素（100 μg/mL）（HiMedia，印度）的Luria-Bertani（LB）培养基在37°C下培养来扩增克隆的LTV质粒。将4xM2e或Ii-P-4xM2e基因克隆入线性化模板载体（LTV）已得到确认。

从转化的大肠杆菌DH5α细胞中分离的重组质粒经PCR扩增以检测4xM2e或Ii-P-4xM2e基因的存在。扩增产物大小分别为4xM2e的333 bp和Ii-P-4xM2e的597 bp，与预期大小一致，表明目标基因克隆成功（图1，面板B：a，c）。通过EcoRI和PstI限制酶消化进一步确认，产生了预期大小的片段，证实了……的存在。

讨论

流感病毒基质蛋白2（M2）是流感病毒的一种整合膜蛋白，形成质子选择性离子通道，在病毒复制的早期阶段特别是脱壳过程中发挥重要作用[78]，[79]。M2蛋白的N端胞外域，即M2e，是一段约23个氨基酸的短肽，在流感A病毒亚型间高度保守，使其成为开发交叉保护性通用流感疫苗的诱人靶标[32]。

结论

总之，我们证明了一种LNP配制的mRNA疫苗，编码与PADRE和恒定链基序融合的保守M2e抗原，在鸡中对H9N2禽流感是安全的并诱导保护性免疫。PADRE和Ii的加入增强了原本较弱的M2e表位的免疫原性，促进了体液和细胞免疫应答。这些结果支持了基于保守抗原的mRNA疫苗作为更广泛控制AIV的补充策略的潜力。

作者贡献声明（CRediT）

Sandeep Yadav：撰写—审阅与编辑，撰写—初稿，方法论，调查，形式分析，数据整理。Aparna Varma：撰写—审阅与编辑，方法论，形式分析。Shraman Jana：撰写—审阅与编辑，方法论，形式分析。Samiran Mondal：撰写—审阅与编辑，方法论，形式分析。Shayan Sharif：撰写—审阅与编辑，概念化。Amirul Islam Mallick：撰写—审阅与编辑，撰写—初稿，监督。

伦理批准和参与同意

经研究所生物安全委员会（IBSC）批准，所有涉及低致病性（LP）A型流感病毒的所有实验均在BSL-II设施中按照DBT指南进行，仅用于研究目的。上述方案的许可证号为IISERK/IBSC/2019/005（H1N1）和IISERK/IBSC/2020/007（H9N2）。

鸡实验方案经印度科学教育研究所动物伦理委员会（IAEC）批准。

资金来源

部分资助来自印度政府科学技术部先进材料司；项目编号：DST/NPNST/AM/2025/51（G）（TPN：119294）。

利益冲突声明

作者声明他们不存在已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文所报告的工作。

致谢

SY感谢IISER Kolkata提供博士奖学金；AV感谢CSIR和印度政府教育部提供奖学金支持。我们感谢IISER Kolkata的纳米颗粒跟踪分析（NTA）设施对LNPs的表征。我们还感谢IISER Kolkata中央仪器设施（CIF）提供仪器支持。衷心感谢IISER Kolkata动物设施的Anu Das先生协助体内研究，以及IISER Kolkata的Tamal Gosh先生。

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