《Vaccine》：mRNA encoding norovirus VP1 produces antigenically functional virus-like particles
in vitro
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人诺如病毒（human norovirus）是全球各年龄组急性胃肠炎（acute gastroenteritis）的主要病因，但目前尚无获批疫苗。主要衣壳蛋白VP1可自组装为高度免疫原性的病毒样颗粒（VLPs），并在临床研究中显示潜力。近期，mRNA已成为诺如
人诺如病毒（human norovirus）是全球各年龄组急性胃肠炎（acute gastroenteritis）的主要病因，但目前尚无获批疫苗。主要衣壳蛋白VP1可自组装为高度免疫原性的病毒样颗粒（VLPs），并在临床研究中显示潜力。近期，mRNA已成为诺如病毒疫苗的有吸引力的平台。然而，编码VP1的mRNA能否在与疫苗接种环境相关的人细胞中驱动真实VLP形成仍不清楚。本研究使用多种人细胞系，包括THP-1来源的巨噬细胞样细胞，以模拟疫苗接种后环境。转染诺如病毒GII.4 VP1 mRNA或脂质纳米颗粒（LNP）配制的VP1 mRNA均可诱导细胞内和细胞外VP1表达。蔗糖梯度纯化和电子显微镜确认了VLP组装。这些颗粒保留了关键抗原性和功能特性，包括被人血清中诺如病毒特异性抗体识别以及与组织血型抗原（HBGAs）结合。总之，本研究结果提供直接证据，表明编码VP1的mRNA可在生理相关的人细胞系统中产生结构和功能相关的诺如病毒VLPs。这些结果强化了基于mRNA的诺如病毒疫苗的机制依据，并支持其持续开发。
Reyes Ballista等围绕mRNA编码诺如病毒主要衣壳蛋白VP1能否在与人疫苗接种相关的细胞环境中形成结构和功能完整的病毒样颗粒（virus-like particles，VLPs）开展研究。人诺如病毒（human norovirus）是全球食源性疾病和急性胃肠炎（acute gastroenteritis）的重要原因，主要经粪口途径传播，可在游轮、医院和托幼机构等场所发生人际传播，症状包括腹泻、呕吐和恶心，通常持续1—3天；儿童、老年人和免疫缺陷者更易出现住院和死亡等严重后果。其全球直接医疗成本和生产力损失估计约每年650亿美元。诺如病毒为杯状病毒科无包膜正义单链RNA病毒，分为GI—GX十个基因群和约48个基因型；GII.4基因型自20世纪90年代中期以来占全球暴发的60%—80%，且与其他基因型相比与更差结局相关，因此成为疫苗开发的重要靶点。诺如病毒基因组约7.6 kb，含三个开放阅读框，编码六个非结构蛋白及VP1和VP2两个结构蛋白；衣壳主要由VP1组成，约180个拷贝形成二十面体颗粒，VP1在细胞中表达后可自组装为结构类似天然病毒的VLPs。已有基于VLPs的疫苗进入临床研究，如Takeda二价候选疫苗已推进至2期临床试验；与传统VLP方法相比，mRNA技术可更快纳入高度多样病毒的新兴基因型。已有研究表明脂质纳米颗粒（lipid nanoparticle，LNP）包封的mRNA疫苗可在注射部位招募的免疫细胞中诱导SARS-CoV-2刺突蛋白表达，迁移至引流淋巴结后mRNA和蛋白主要在抗原提呈细胞尤其巨噬细胞中检测到；诺如病毒VLP从mRNA产生也已在Expi293F细胞中展示，但VP1 mRNA能否在与人肌内接种相关的条件下指导正确VLP组装仍不清楚。由于mRNA疫苗在注射部位招募包括巨噬细胞在内的多种抗原提呈细胞，研究人员用THP-1来源巨噬细胞样细胞模拟该细胞环境；鉴于THP-1来源M0巨噬细胞固有免疫感知较强、可降低外源核酸摄取和转染效率，研究人员还评估了HepG2和Expi293F细胞。研究结果表明，GII.4 VP1 mRNA及mRNA-LNP可在多个人细胞系中表达VP1并组装为VLPs，纯化颗粒保留被人血清抗体识别及结合组织血型抗原（histo-blood group antigens，HBGAs）的功能，为mRNA诺如病毒疫苗提供机制支持。
方法上，研究人员制备带N
1-甲基假尿苷三磷酸修饰和clean-cap的GII.4 VP1 mRNA，并以微流控混合制备mRNA-LNP；在THP-1来源M0巨噬细胞样细胞、HepG2和Expi293F细胞中转染未配制mRNA或mRNA-LNP，48 h后收集上清与裂解物，以常规或毛细管western blot检测VP1，经蔗糖梯度超速离心纯化，结合透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）、动态光散射（dynamic light scattering，DLS）、Coomassie染色和蛋白定量表征；用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测VLP与人血清IgG结合，用猪胃黏蛋白（porcine gastric mucin，PGM）结合及HBGA阻断试验评价功能。人血清样本购自Discovery Life Sciences，ELISA结合使用2022—2023年15名供者血清，HBGA阻断使用8份血清；GII.4c VLP功能评价使用4份血清。
3.1. 递送编码VP1的mRNA可在体外产生诺如病毒病毒样颗粒：研究人员将GII.4 VP1 mRNA转染THP-1 M0、HepG2和Expi293F细胞，48 h后以毛细管western blot在上清和细胞裂解物中检测到VP1；将上清与裂解物合并后经蔗糖梯度超速离心，各梯度组分免疫印迹显示VP1信号峰值位于组分5—7，符合正确组装VLP的密度特征；纯化颗粒经免疫印迹和TEM显示具有预期二十面体衣壳结构，GII.4c VP1在THP-1细胞中亦观察到类似结果；DLS显示mRNA来源VLP平均粒径在THP-1细胞中为53.4 nm、HepG2为115.4 nm、Expi293F为131.8 nm，并检测到约10 nm和约1000 nm的次级群体，提示样品异质性及较小VP1组装体和较大聚集物存在。由此得出，mRNA编码的诺如病毒GII.4 VP1可在多个人细胞系中自组装为VLPs。
3.2. LNP包封的诺如病毒VP1 mRNA可在体外产生病毒样颗粒：鉴于诺如病毒mRNA疫苗候选采用LNP配制，研究人员进一步用平均粒径79 nm的mRNA-LNP在HepG2和Expi293F细胞中评价VLP产生；HepG2可产生ApoE并表达LDL受体，支持LNP包封mRNA的内吞。结果显示，mRNA-LNP递送后HepG2和Expi293F细胞的裂解物与上清中均检测到VP1，经蔗糖梯度纯化后免疫印迹显示预期分子量，TEM显示预期形态；DLS显示mRNA-LNP来源VLP平均粒径在HepG2为163.6 nm、Expi293F为156.6 nm，类似地提示样品异质性。THP-1 M0细胞中未成功检测到mRNA-LNP来源VLP产生。最终制备总蛋白浓度分别为THP-1、HepG2和Expi293F来源mRNA VLP 1.831、1.078和0.724 mg/mL，HepG2和Expi293F来源mRNA-LNP VLP为1.099和0.644 mg/mL；总蛋白染色显示VP1预期分子量附近有明显条带及额外蛋白种类，因此这些数值代表最终制备总蛋白而非VP1特异浓度或绝对VLP产量。由此得出，LNP包封的VP1 mRNA也可在体外产生VLPs，结果与未配制mRNA来源制备相当。
3.3. 由DNA、mRNA和mRNA-LNP产生的纯化GII.4 VLPs与人血清阳性样本结合滴度相当：为评价mRNA来源VLP是否保留相关抗原特性，研究人员用ELISA检测其与2022—2023年收集的15份人血清样本抗体结合；三个代表性供者的结合曲线显示DNA、mRNA和mRNA-LNP来源VLP均呈剂量依赖性血清结合，15份样本的终点滴度经Spearman相关分析显示所有VLP制备之间强相关（r > 0.9）。由此得出，mRNA来源VLPs在人血清抗体识别方面保留了与DNA来源VLPs高度相似的抗原特性。
3.4. 诺如病毒mRNA来源VLPs与HBGA的结合可被人血清抗体剂量依赖性阻断：由于人诺如病毒体外培养困难，领域内采用HBGA阻断试验作为活病毒中和试验的替代，HBGAs是存在于生物体液和黏膜上皮、对诺如病毒进入重要的附着因子。研究人员首先用PGM作为HBGA聚糖来源，发现HepG2细胞中mRNA和mRNA-LNP来源VLPs均呈剂量依赖性结合PGM，二者无统计学显著差异；随后用8份人血清比较HBGA阻断滴度，预孵育各VLP制备与系列稀释血清可剂量依赖性抑制PGM结合，代表性样本显示mRNA与mRNA-LNP来源VLP的半数阻断滴度（BT50）相似，组间无统计学显著差异；此外，THP-1细胞产生的GII.4c VLPs对4份人血清进行PGM结合和HBGA阻断评价，4份血清抗VP1 ELISA滴度从非结合到高结合不等，VLPs显示剂量依赖性PGM结合并进一步评价了血清阻断滴度。由此得出，mRNA和mRNA-LNP来源VLPs可被诺如病毒特异性抗体识别，并保留功能性HBGA结合特性。
讨论部分总结：作者指出诺如病毒VLPs在结构和免疫学上模拟天然病毒，本研究证明mRNA编码VP1可在多个人细胞系中产生VLPs，未配制mRNA和LNP包封mRNA均可诱导致细胞内和细胞外VP1表达，蔗糖梯度纯化、免疫印迹和电镜显示VP1自组装为VLPs，且人血清抗体结合和HBGA阻断试验证实其体外功能。作者注意到THP-1细胞中VP1在上清较裂解物更明显，而HepG2和Expi293细胞呈相反趋势，并指出该差异机制尚不明确；由于诺如病毒VP1缺乏经典分泌信号，上清中VP1可能来自非经典囊泡介导释放或膜损伤、凋亡、细胞裂解相关被动释放，本研究不能区分这些可能，因此上清中VP1颗粒不应解释为主动VLP分泌证据。作者认为mRNA平台可克服传统重组VLP生产耗时和需大量优化等问题，并支持对遗传多样病毒快速更新序列；但VLP形成型mRNA疫苗能否诱导与预形成VLP免疫相当持久性的免疫应答仍不清楚，需更多人数据。作者还指出诺如病毒VLP组装和结构可随表达系统变化，天然病毒为T = 3二十面体对称、由180个VP1分子组成，而GII.4 VLPs可异质组装为T = 1、T = 3和主要T = 4对称颗粒，本研究TEM未达到足够分辨率或采样深度以分配特定三角剖分数，梯度组分可能含混合VLP种类，未来需组分特异和高分辨率结构分析；本研究也缺乏纯化前细胞内VLP组装的直接高分辨率可视化，未来可用超薄切片TEM、免疫金标记或冷冻电镜提供更明确证据。作者进一步指出mRNA和mRNA-LNP来源VLPs呈现人抗诺如病毒抗体识别的表位，不完整VLP组装可使HBGA结合口袋形成不良而仍暴露线性或柔性区抗体表位，因此ELISA检测抗体不一定代表保护；本研究结果支持mRNA编码VLP保留HBGA结合口袋，并在HBGA结合和阻断试验中与DNA来源VLP相当。作者承认局限：体外转染模型不能预测体内免疫应答的强度、质量或持久性；细胞摄取和表达可能不能准确反映mRNA-LNP在体内的生物分布或组织特异转运；因此本研究应解释为支持mRNA驱动诺如病毒VLP产生及抗原功能可行性的机制证据，而非疫苗免疫原性或保护的直接证据，未来需明确体外VLP产生、体内抗原表达与免疫细胞识别及免疫应答质量之间的关系。
研究结论翻译：总体而言，本研究结果表明，递送编码GII.4 VP1的mRNA，无论作为未配制mRNA还是LNP包封mRNA，均可在体外产生结构和功能相关的诺如病毒VLPs。所得颗粒可被血清阳性人血清识别，并保留HBGA结合和血清阻断活性。这些发现为基于mRNA的诺如病毒疫苗提供机制支持，并突出VLP形成型mRNA平台在快速且可适应疫苗开发中的潜力。
