基于CRISPR碱基编辑与先导编辑的平滑肌细胞疾病建模及精准治疗研究进展

《Vascular Pharmacology》：CRISPR-based genome editing of smooth muscle cells: Disease models, therapeutic applications, and future perspectives

　　

平滑肌细胞（SMCs）对心血管、呼吸、胃肠和泌尿生殖系统的正常功能至关重要，而SMC功能障碍参与多种遗传性和获得性疾病。基于成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）的基因组编辑为研究SMC生物学和开发平滑肌疾病治疗提供了新途径。特别是，碱基编辑（base editing）和先导编辑（prime editing）能够在不引入DNA双链断裂（DNA double-strand breaks）的情况下实现精确的核苷酸改变。在本综述中，研究人员总结了CRISPR技术在平滑肌生物学中的近期应用，并主要聚焦于血管疾病。研究人员讨论了如何利用CRISPR工程化的原代细胞、诱导多能干细胞来源的SMC（iPSC-SMCs）和动物模型来研究疾病机制并验证致病性变异。研究人员进一步综述了在患者来源iPSC-SMCs、血管类器官（vascular organoids）和临床前动物模型（preclinical animal models）中纠正致病变异的治疗性基因组编辑策略。最后，研究人员讨论了临床转化面临的主要挑战，包括高效且SMC特异性的递送、免疫原性（immunogenicity）、编辑精准性（editing precision）、脱靶效应（off-target effects）和长期安全性（long-term safety）。基因组编辑技术、递送平台和人类疾病模型的持续进步可能将这些方法的应用拓展至平滑肌疾病。

研究人员围绕基于CRISPR的基因组编辑在平滑肌细胞（SMC）疾病模型、治疗应用及转化挑战展开综述。SMC广泛分布于心血管、呼吸、胃肠和泌尿生殖系统，其收缩功能依赖细胞内钙升高；钙离子与钙调蛋白结合后激活肌球蛋白轻链激酶（MLCK），后者磷酸化调节性肌球蛋白轻链，促进粗、细肌丝相互作用。分化SMC呈收缩表型，高表达平滑肌α-肌动蛋白（ACTA2）、transgelin（TAGLN）、calponin（CNN1）和平滑肌肌球蛋白重链（MYH11）等收缩蛋白；同时具有显著可塑性，在环境应激下发生SMC表型转换，表现为收缩蛋白表达下降、重新进入细胞周期、增殖和迁移增强，以及细胞外基质和炎症介质合成增加。该过程虽参与损伤后血管修复，但其持续激活与主动脉瘤、动脉粥样硬化和再狭窄等血管疾病相关。CRISPR-Cas9（CRISPR-associated protein 9）可靶向切割DNA以破坏、修复或替换疾病相关基因；碱基编辑和先导编辑（PE）无需DNA双链断裂即可实现靶向核苷酸改变，降低插入、缺失和染色体重排风险。碱基编辑器由Cas9切口酶与脱氨酶融合而成，在单向导RNA（sgRNA）引导下于编辑窗口内催化碱基替换；胞嘧啶碱基编辑器（CBE）介导C:G向T:A转换，腺嘌呤碱基编辑器（ABE）介导A:T向G:C转换，CGBE、AYBE和TBE等拓展了可编程单碱基替换谱。PE由Cas9切口酶与工程化逆转录酶融合，pegRNA既指定靶点又引入所需编辑，可产生替换、插入和缺失；PE2–PE6和PEmax等提升了编辑效率、产物纯度和靶向范围，但效率通常仍低于碱基编辑器。上述技术为SMC疾病机制解析和精准治疗提供了平台。

关键技术方法方面，综述整合患者来源iPSC-SMCs、血管类器官、生物工程血管移植物及基因工程动物模型等研究证据；涉及CRISPR-Cas9、同源定向修复（HDR）、碱基编辑、先导编辑、AAV9/AAV-PR递送、平滑肌特异性启动子和非病毒纳米载体等技术；样本来源包括患者来源iPSC及iPSC-SMCs、血管类器官和多种小鼠模型。该部分不超过250字。

研究结果如下。1. 平滑肌细胞生物学：通过综述SMC收缩机制、收缩表型标志和表型转换，指出SMC可塑性及持续表型转换参与主动脉瘤、动脉粥样硬化和再狭窄等血管疾病。2. 基于CRISPR的基因组编辑技术：通过总结Cas9切割、碱基编辑和PE，指出碱基编辑可实现C:G→T:A、A:T→G:C等替换，PE可产生替换、插入和缺失，从而拓展可纠正致病变异谱。3. 基于CRISPR基因组编辑的SMC疾病建模：通过CRISPR-HDR将MED12 Gly44功能获得性突变引入原代人子宫SMC，构建子宫平滑肌瘤等位基因模型；通过iPSC等位基因系研究马凡综合征（MFS）、Loeys-Dietz综合征（LDS）和血管型Ehlers-Danlos综合征（vEDS）；通过Lmod1敲除小鼠和Actg2^R257C/+小鼠复制巨膀胱-微结肠-肠蠕动不良综合征（MMIHS）表型，得出CRISPR工程化人SMC和动物模型可验证致病变异并剖析疾病机制。4. SMC中靶向治疗性CRISPR基因组编辑：通过MFS中FBN1突变校正、LDS中TGFBR1^A230T引入与校正、vEDS中COL3A1 c.755G > T校正，以及CADASIL中NOTCH3 c.1261C > T和HGPS中LMNA c.1824C > T的腺嘌呤碱基编辑，结合血管类器官和生物工程血管移植物中TGFBR1^A230T校正，得出突变校正可挽救疾病相关表型；通过AAV9介导的ABE校正ACTA2^R179H/+小鼠及定制ABE/AAV-PR递送，得出体内碱基编辑可改善血管和内脏表现；主动脉中靶编辑效率约5%和3%，而VSMC仅占主动脉组织约10–20%，提示低编辑效率可产生组织水平获益。5. 当前挑战与未来方向：通过分析递送、免疫原性、编辑精准性和长期安全性问题，指出AAV存在包装容量、预存中和抗体（NAbs）、补体激活、CD8⁺ T细胞反应及高剂量免疫毒性等限制；非病毒脂质纳米颗粒（LNPs）和病毒样颗粒（VLPs）具重复给药和低免疫原性潜力但需优化；同时需开发更准确Cas变异体、工程化脱氨酶、优化sgRNA和瞬递送系统，并利用SMC选择性启动子、工程化AAV衣壳和靶向LNP提高特异性。讨论部分进一步指出，临床转化需基础科学家、临床医生、生物技术公司、监管机构和医疗机构协作；“Baby KJ”的个性化体内CRISPR碱基编辑治疗CPS1（carbamoyl-phosphate synthetase 1）缺乏症提供了框架，但N-of-1疗法成本高、资源密集，需探索共享致病信号通路（如CaMK2δ、PKCα）、高通量CRISPR筛选、单细胞多组学和空间转录组学，以及CRISPRi/CRISPRa和表观遗传调控等替代策略。6. 结论（翻译）：基于CRISPR的基因组编辑已成为研究平滑肌生物学的重要工具，能够支持疾病建模、机制研究和新的治疗策略开发。碱基编辑和先导编辑的出现极大拓展了致病变异的精准纠正，同时降低DNA双链断裂相关风险。结合患者来源iPSC模型、血管类器官、生物工程组织和基因工程动物模型，这些技术为平滑肌疾病分子机制提供了新见解，并促进了基因组编辑疗法的临床前评价。近期在遗传性平滑肌疾病模型中成功实现体内基因组编辑的研究进一步支持直接靶向SMC以恢复组织功能并阻止疾病进展的可行性。尽管仍存在高效且细胞类型特异性递送、长期安全性和监管考量等重要挑战，基因组编辑工具和递送系统的持续改进有望进一步拓展其治疗潜力。总之，这些进展确立了基于CRISPR的基因组编辑作为研究平滑肌疾病机制和开发针对遗传性及获得性平滑肌疾病精准疗法的有价值平台。