兔、犬和猫脂肪组织中SSEA-3+/CD105+细胞群的鉴定与表征：面向兽医再生医学的Muse样细胞免疫表型研究

《Veterinary and Animal Science》：Identification and characterization of SSEA-3?/CD105? cells in adipose tissue of rabbits, dogs, and cats: insights into a Muse-like cell population

　　

Muse（multilineage-differentiating stress-enduring）细胞是间充质干细胞（MSCs）群体中的内源性多能样干细胞亚群。为鉴定兔、犬和猫脂肪组织来源脂肪间充质干细胞（ADSCs）中的SSEA-3⁺/CD105⁺细胞群并评估其Muse样免疫表型，研究人员采用免疫细胞荧光检测SSEA-3（stage-specific embryonic antigen-3，阶段特异性胚胎抗原-3）与CD105（endoglin）共表达，并对兔SSEA-3⁺/CD105⁺细胞经磁激活细胞分选（MACS）纯化后检测Nanog、Oct3/4和Sox2表达。结果显示，兔、犬和猫ADSCs中SSEA-3⁺/CD105⁺细胞比例分别为54.84±7.34%、39.93±9.58%和50.61±16.67%，三物种间未见显著差异；纯化兔SSEA-3⁺/CD105⁺细胞中Nanog⁺、Oct3/4⁺和Sox2⁺比例分别为87.65±5.16%、88.96±1.55%和89.15±2.84%。研究提示，兔、犬和猫脂肪组织含有SSEA-3⁺/CD105⁺Muse样细胞群，脂肪组织可作为兽医再生医学中可获得的Muse样细胞来源；然而，多能性标志物表达本身不足以证明多能性，仍需功能学验证。

研究背景与问题：兽医再生医学在骨关节炎、器官纤维化和神经系统疾病中日益关注间充质干细胞（MSCs）和富血小板血浆（PRP）。MSCs具有自我更新和多向分化能力，可分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。2010年Dezawa研究组在MSC群体中发现Muse（multilineage-differentiating stress-enduring）细胞，其可自发分化为三胚层衍生物，经鞘氨醇-1-磷酸（S1P）–S1PR2轴迁移至损伤组织，具高应激耐受及抗凋亡、抗纤维化和抗炎特性，且非致瘤、免疫耐受，可从骨髓、脂肪和皮肤等成人组织分离而无需基因诱导；其Oct3/4、Sox2、Nanog表达低于胚胎干细胞（ESCs）。SSEA-3（stage-specific embryonic antigen-3）广泛用于Muse细胞分离，CD105（endoglin）为MSC标志；SSEA-3为糖脂而非蛋白表位，具有跨物种保守性，并可能参与FGF2依赖自我更新、克隆形成、干性维持和谱系承诺。既有Muse细胞证据覆盖小鼠、大鼠、兔、猪、山羊、绵羊、马、犬和猫，但异质性强；脂肪来源Muse细胞研究少且标志有限，多集中于骨髓间充质干细胞（BMSCs），脂肪库和分离方法对产率的影响尚不明确。本研究目的为通过免疫细胞荧光在兔、犬、猫脂肪组织鉴定SSEA-3⁺/CD105⁺细胞，并在纯化兔双阳性细胞中评估Sox2、Nanog和Oct3/4表达。

研究开展与结论意义：研究人员采集兔、犬、猫脂肪组织，原代培养ADSCs，以免疫细胞荧光检测SSEA-3与CD105共表达；对兔ADSCs经MACS依次纯化SSEA-3⁺再CD105⁺，检测纯化双阳性细胞多能性相关标志。结果显示三物种ADSCs均存在SSEA-3⁺/CD105⁺细胞，比例分别54.84±7.34%、39.93±9.58%和50.61±16.67%，种间无显著差异；纯化兔双阳性细胞高表达Nanog、Oct3/4和Sox2。结论提示兔、犬、猫脂肪组织含Muse样免疫表型细胞，脂肪组织为兽医再生医学可及来源；但功能身份未证实，多能性标志表达不等于多能性。

关键技术方法（≤250字）：样本来源为7只健康雌性新西兰兔（7月龄，约4 kg）腹股沟脂肪、3只健康成年雌犬镰状韧带脂肪（择期卵巢切除术）和3只健康年轻成年猫肠系膜脂肪（择期卵巢切除术）；伦理批准号2023-VSC-PEA-0242。主要技术包括原代ADSCs培养与扩增；免疫细胞荧光检测SSEA-3/CD105共表达；兔ADSCs采用MACS依次分选SSEA-3⁺和CD105⁺细胞；纯化兔SSEA-3⁺/CD105⁺细胞以免疫细胞荧光检测Nanog、Oct3/4、Sox2；ImageJ盲法定量，Kruskal–Wallis检验比较三物种双阳性比例。

研究结果：3.1 兔：对7只兔ADSCs行免疫细胞荧光，SSEA-3^-/CD105⁺为23.14±7.15%，未检出SSEA-3⁺/CD105^-，SSEA-3⁺/CD105⁺为54.84±7.34%，双阴性为22.02±5.00%。对1只兔ADSCs经MACS顺序纯化后，双阳性比例达88.36±0.98%；纯化双阳性细胞中Nanog⁺、Oct3/4⁺和Sox2⁺分别为87.65±5.16%、88.96±1.55%和89.15±2.84%（按显微镜视野描述）。3.2 犬：对3只犬ADSCs行免疫细胞荧光，SSEA-3^-/CD105⁺为53.15±11.27%，SSEA-3⁺/CD105^-为4.61±2.16%，双阳性为39.93±9.58%，双阴性为2.31±1.58%。3.3 猫：对3只猫ADSCs行免疫细胞荧光，SSEA-3^-/CD105⁺为30.40±17.51%，SSEA-3⁺/CD105^-为13.77±1.89%，双阳性为50.61±16.67%，双阴性为5.21±1.06%。三物种双阳性比例比较未见显著差异。

讨论总结：讨论指出CD105/endoglin在MSCs高表达，SSEA-3为多能干细胞标志性糖脂；Muse细胞可依据SSEA-3与CD105双阳性从MSCs分离，具自我更新、非致瘤和三系分化潜能。SSEA-3除标志作用外，可能参与FGF2依赖自我更新、克隆形成、干性维持和谱系承诺。既往跨物种Muse细胞比例总体较低：人BMSCs约1.1%、ADSCs约1.91–8.8%；兔BMSCs约0.5%；小鼠BMSCs/ADSCs/成纤维细胞约3.0%/2.6%/2.1%；大鼠BMSCs约2.3%；猪BMSCs约2%；山羊成纤维细胞约4%；马BMSCs约2.1%；小鼠ADSCs约2.6–6.3%；绵羊约15.6%；犬长期胰蛋白酶处理（LTT）耐受细胞约9.3%但表型不同；犬猫脐带间充质干细胞（UC-MSCs）/ADSCs的SSEA-3⁺比例更低。本研究比例较高，需谨慎解释。可能影响因素包括物种和脂肪库（兔腹股沟、犬镰状韧带、猫肠系膜）、供体年龄/性别/体质指数（BMI）、培养条件（如氧张力）、传代和细胞密度、抗体特异性与种属验证、免疫荧光定量标准及MACS/荧光激活细胞分选（FACS）/LTT等分离方法；这些因素未被直接研究，故相关解释为探索性。Nanog、Oct3/4、Sox2为多能性标志，Muse细胞通常低于ESCs/iPSCs；本研究纯化兔双阳性细胞三者高表达，但仅1只兔、描述性，且无种属特异性抗体验证、无阳性/同型对照；表达本身不构成功能多能性证据。研究限制包括样本量小、MACS仅1只兔、多能性标志仅检测兔、SSEA-3⁺/CD105^-亚群可能被排除、脂肪部位不一致、免疫荧光与流式细胞术敏感性/细胞数量/定量不同。SSEA-3⁺/CD105⁺细胞应视为免疫表型富集的Muse样群体，需应激耐受、自我更新、自发三系分化和损伤迁移等功能实验确认。

研究结论（译）：本研究对兔、犬、猫ADSCs中SSEA-3⁺/CD105⁺细胞群进行了比较表征；该SSEA-3⁺/CD105⁺免疫表型与这些物种脂肪组织存在Muse样群体一致。在兔中，SSEA-3⁺/CD105⁺细胞的免疫磁珠分离显示分离群体表达Nanog、Oct3/4和Sox2；然而，这些标志物单独表达不能证明多能性，仍需进一步功能表征以确定其是否具多能特性。因此，本研究的比较部分限于三物种SSEA-3⁺/CD105⁺群体的免疫表型表征，而多能性相关标志评估限于兔细胞。尽管个体差异、物种、脂肪组织来源、培养条件、抗体特异性及细胞鉴定和定量方法可能影响观察结果并限制与既往研究的直接比较，这些发现扩展了兽医物种中呈Muse样免疫表型SSEA-3⁺/CD105⁺细胞群的现有知识。总体而言，本研究为未来确认该细胞群生物学特性、评估潜在种间差异及探索其在再生医学中的相关性提供了基础。