CRISPR/Cas12a 驱动的自维持催化核酸回路用于黄曲霉毒素 B1 的高灵敏检测

《Talanta》：CRISPR/Cas12a-powered self-sustaining catalytic nucleic acid circuit for highly sensitive detection of aflatoxin B1

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  基于CRISPR的自催化回路实现了AFB1的高灵敏、高准确检测。
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  该传感器通过一步法、单酶过程实现了AFB1的快速检测。
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  所设计的"双翼探针"实现了荧光信号放大。
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  该传感器检测限达7.5 pg/mL，具有优异的定量能力。

引言

黄曲霉毒素B1（AFB1）是由Aspergillus flavus（黄曲霉）和Aspergillus parasiticus（寄生曲霉）产生的高毒性次生代谢产物[1]。作为一种强致癌物，它广泛污染玉米、花生、坚果和谷物等重要农产品[2]。由于其显著的耐热性和化学稳定性，常规食品加工方法往往无法有效消除AFB1[3]。饮食中低剂量暴露于AFB1与人类肝癌发病率升高和多器官损伤密切相关，对公共卫生构成严重威胁[4]。目前，尽管基于色谱-质谱联用[5]、[6]和免疫分析[7]的传统方法具有较高的准确性，但它们依赖于昂贵的大型仪器、复杂的样品前处理和专业人员。这严重限制了其低成本快速现场检测的能力。因此，设计具有高灵敏度、快速响应和优异稳定性的新型AFB1检测策略对于保障食品安全至关重要。

近年来，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）及CRISPR相关（Cas）蛋白系统凭借其高特异性、模块化设计和可编程性等独特优势，在食品安全检测领域展现了革命性潜力[8]、[9]。特别是，该系统能够高效识别靶标并放大信号，其独特的反式切割活性为实现小分子、核酸和蛋白质的高灵敏检测提供了创新途径[10]、[11]、[12]。值得注意的是，通过采用适配体作为信号转导桥梁，可将靶标转化为可被CRISPR系统精准识别的核酸序列，从而显著提高对食品中污染物的检测能力。例如，Zhang等通过合成嵌有普鲁士蓝的核壳纳米颗粒，设计了一种基于CRISPR的表面增强拉曼散射（SERS）平台，开发了用于灵敏检测AFB1的比率型生物传感器[13]。此外，Liu等合成了具有高过氧化物酶活性的Fe-N-C单原子酶和Fe-Co磁性纳米颗粒，构建了一种经济、易操作且高特异性的CRISPR/Cas12a介导的显色生物传感器，用于检测AFB1[14]。尽管CRISPR系统凭借其可编程性和特异性为小分子检测提供了优良基础，但其有限的灵敏度仍然阻碍了其在低丰度靶标高效检测中的实际应用。

基于核酸的生化反应回路因其高度可编程性而受到广泛关注[15]、[16]。这些回路可以在等温条件下实现信号的自放大，并通过级联或循环反应产生多重信号输出。这种方法为将CRISPR/Cas系统与催化核酸回路整合以构建信号放大平台提供了新视角。例如，Shi等报道了一种基于CRISPR/Cas12a的自催化反馈放大平台，用于高灵敏DNA检测[17]。鉴于Cas系统的输入和输出均与核酸相关，设计功能核酸模块可能使活化的Cas蛋白实现自催化行为，从而以这种方式构建的基于CRISPR/Cas的正反馈回路可以显著提高催化效率，用于小分子的超灵敏检测。然而，这一策略尚未得到进一步探索。

在此，我们开发了一种由CRISPR/Cas12a驱动的自持催化核酸回路（CPSCN），用于AFB1的准确灵敏检测（图1）。CPSCN系统由三个模块组成：输入传感器（S1）、信号转换器（S2）和信号放大器（Amp）。Amp被设计为一对单链DNA（ssDNA）锁定的向导RNA2（gRNA2）探针，分别标记有6-羧基荧光素（FAM）和淬灭剂（黑洞淬灭剂1，BHQ1），称为"双翼荧光探针"。首先，在适配体的识别下，AFB1通过适配体的互补DNA（cDNA）间接触发S1（Cas12a/gRNA1复合物）的激活，随后切割"双翼荧光探针"，初步产生荧光信号并释放gRNA2。释放的gRNA2随后驱动S2（Cas12a/aDNA）组装成新的复合物（Cas12a/gRNA2），进而切割"双翼荧光探针"，从而在S2和Amp之间形成自持的正反馈回路。该回路使gRNA2能够在局部反应空间内持续积累，最终实现级联信号放大。本研究为痕量小分子检测提供了一种高效、自驱动的创新解决方案。

章节摘要

化学试剂

LbCas12a（Cpf1）来源于Lachnospiraceae bacterium（梭杆菌属细菌），购自上海拓落生物科技股份有限公司。所有核酸序列、DNA标记物（25-50 bp）、4S GelRed核酸染料和DEPC处理的无核酸酶水均由上海生工生物工程有限公司提供。反应缓冲液A（40 mM HEPES，100 mM NaCl，20 mM MgCl₂，pH 7.4）购自北京诺贝尔莱德科技有限公司（北京，中国）。用于电泳的3%琼脂预制凝胶、1×TBE运行缓冲液和5×

检测原理

CPSCN传感器检测AFB1的原理如图1所示。该传感系统由S1、S2和Amp三个模块组成。首先，在S1模块中，AFB1特异性结合适配体，从而使适配体的互补DNA（cDNA）保持游离状态。未结合的cDNA作为输入信号，被预先组装的Cas12a/gRNA1复合物识别。该识别激活Cas12a切割"双翼荧光探针"，同时产生荧光

结论

总之，本工作成功构建了一种用于AFB1高灵敏快速现场检测的CPSCN传感系统。可切换的gRNA2单元通过循环反应实现信号放大，显著提高了AFB1检测的灵敏度，检测限达7.5 pg/mL。在实际样品检测中，CPSCN系统在花生、玉米和杏仁等复杂基质中表现出令人满意的回收率，范围为82.0%至101.3%，与...结果一致

CRediT作者贡献声明

Wu Zhihui：原稿撰写、方法论、资金获取、数据整理、概念构思。Ma Yucong：数据整理。Li Xiangzhi：形式化分析。Yan Zhengyu：形式化分析。Huang Yu：形式化分析。Wang Kaiqiang：方法论。Quan Wei：方法论。Mo Lan：概念构思。Liu Shi Gang：审阅与编辑、资源获取、方法论、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们不存在已知的可能影响本文所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。

致谢

作者感谢湖南省自然科学基金（2026JJ90242, 2024JJ6237）、湖南省重点研发计划（2025AQ2020）、大学生创新创业训练计划（202510537041X）、湖南省教育厅科学研究基金（24B0202）以及国家自然科学基金（32102074）的支持。

Wu Zhihui|Ma Yucong|Li Xiangzhi|Yan Zhengyu|Huang Yu|Wang Kaiqiang|Quan Wei|Mo Lan|Liu Shi Gang