整体式旋转柱脱盐：一种快速、与尺寸无关的高通量核酸纯化解决方案

《Talanta》：Monolithic Spin Column Desalting: A Rapid and Size-Independent Solution for High Throughput Nucleic Acid Cleanup

　　

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  采用旋转柱格式实现各种核酸快速脱盐的平台方法
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  无论基质复杂度如何，均可在10分钟内高效去除盐分
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  相比超滤，提高了CGE灵敏度并加快了处理速度

引言

生物制药行业正在迅速扩大核酸药物的应用范围，包括质粒DNA（pDNA）、信使RNA（mRNA）和环状RNA，用于疫苗、基因治疗和基因组编辑[1]、[2]、[3]。除这些大尺寸生物制造分子外，还有短合成核酸，如小干扰RNA[4]、反义寡核苷酸[5]、向导RNA[6]和适配体[7]，它们能够实现对基因表达或分子识别的高度特异性控制，使其成为现代生物技术和精准医学中用于诊断、基因组编辑以及遗传性、病毒性和癌症相关疾病治疗的必备工具。在核酸的治疗应用中，关键质量属性（包括纯度和完整性）必须在其生产的各个阶段进行监测和准确表征[8]、[9]。液相色谱（LC）[10]、[11]、[12]、毛细管电泳（CE）[13]、[14]、[15]以及离子淌度光谱法（常与质谱（MS）联用）[16]是研究核酸序列完整性、化学修饰、高级结构、折叠途径和配体相互作用[17]的成熟技术。其中，毛细管凝胶电泳（CGE）提供最高的分辨率和分离能力[12]、[18]。它是区分核酸物种的有力工具，但其性能严重依赖于输入样品的质量。盐、 chaotropes（变性剂）或复杂基质的存在可能会损害重现性，尤其是在电渗（EK）进样过程中[19]。因此，样品预处理——特别是脱盐——对于准确且可重复的CGE分析至关重要。

在CGE之前，有多种核酸预处理策略可供选择，每种策略各有其独特的优点和局限性。1）酚-氯仿提取后乙醇（EtOH）沉淀长期以来一直是一种标准方法[20]，但由于其依赖有毒溶剂且与自动化不兼容，不太适合现代工作流程。2）使用离心柱的超滤（UF）可同时进行浓缩和脱盐，但需要仔细选择膜材料和分子量截留值（MWCO）。虽然UF应用广泛，但它可能导致剪切损伤、回收率波动和吸附损失[16]。3）固相萃取是一个多样化的类别，包括硅基材料、阴离子交换（AEX）树脂和羟基磷灰石[21]、[22]。硅胶介质（常用于商业试剂盒）在富含变性剂的缓冲液中结合核酸，并在水或低盐溶液中释放它们。然而，它们缺乏特异性，可能需要酶处理（如RNase）来实现DNA的选择性回收。固相可逆固定中使用的羧化载体提供了替代方案，但可能引入聚乙二醇和盐的残留。AEX介质利用电荷-电荷相互作用，但通常需要强碱性或高盐洗脱，两者都与脱盐目标不兼容[21]。4）体积排阻/凝胶过滤色谱可在不使用剧烈试剂的情况下实现脱盐[23]，但不能浓缩样品，甚至可能使其稀释，回收率高度依赖于对孔径大小的精心选择[24]。

我们研究的主要重点是开发一种使用色谱整体柱进行核酸脱盐和/或纯化的方法学平台，无需常规色谱系统或特定自动化设备，从而为样品制备提供一种便捷、直接且低成本的方法，特别是针对CGE。先前的研究表明，使用特定的基于AEX的整体材料，可以在中性或弱碱性水溶液中实现pH依赖性的核酸结合和低盐洗脱。Megu?ar等人研究了使用CIM PrimaS整体柱以色谱格式进行mRNA纯化用于制备应用[25]，而Miklav?i?等人则将CIM Swiper整体柱应用于制备性mRNA捕获[26]以及从不同样品基质中进行制备性pDNA脱盐和纯化[27]。这些研究建立了基本的pH响应色谱原理，但未涉及其在基于离心的旋转柱格式中用于快速分析样品制备的应用。与超滤的原理相反，这不是一种分子筛分分离。其行为主要归因于核酸带负电的磷酸骨架与整体柱表面上pH响应性功能基团（属于含氮杂环之一）之间的可逆相互作用[28]。在弱酸性负载条件下，表面具有足够的正电荷以促进核酸结合。将pH值提高至中性条件会降低这种正电荷并减弱相互作用，从而允许在低盐缓冲液中进行洗脱。在本研究中，CIM Swiper材料被改造并在旋转柱工作流程中进行评估，用于从不同基质中对微克级核酸进行脱盐。其性能也与常用的分子量截留离心滤器进行了比较。目标性能标准为：1）脱盐时间在10分钟以内，2）回收率高于80%，3）温和的操作条件，包括中性pH值、室温、低剪切力以及不使用有机溶剂、变性剂和酶；4）与CGE直接兼容；5）适用于复杂工艺衍样品（例如大肠杆菌裂解液）以及不同种类和大小的核酸（如寡核苷酸、pDNA和mRNA）；6）适合平行化和潜在自动化。

章节摘要

化学品和试剂

缓冲液使用去离子水（dH₂O）和分析级试剂新鲜配制，并通过0.22 μm聚醚砜（PES）滤器过滤（Sartolab? RF 500，Sartorius，Gottingen，德国）。

氯化钠（NaCl）、磷酸二氢钠二水合物（NaH₂PO₄·2H₂O）、磷酸氢二钠二水合物（Na₂HPO₄·2H₂O）和乙腈（MeCN）购自Honeywell（美国夏洛特，NC）。乙酸（CH₃COOH）、乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA）、钾

基于整体柱的旋转柱介绍

数十年来，CIM整体柱技术已在制备生物色谱（CIMmultus）[31]、分析生物色谱（CIMac）[13]和诊断应用（CIM 96孔板）[33]中得到确立，但这些格式均不太适合样品净化或小规模样品预处理。因此，开发了CIM旋转柱格式，以实现小样品的快速便捷处理。首先开发了一种小规模且易于使用的离心柱格式，可以

结论

利用核酸与CIM Swiper旋转柱的结合，并在弱碱性pH下用低电导率缓冲液洗脱，得到了一种新颖的、快速的（包括柱制备在内<10分钟）且非常高效的脱盐程序。脱盐样品的电导率与目标缓冲液非常接近，表明其脱盐性能可媲美UF程序的三到五次旋转循环，但处理时间至少缩短了三分之一。所建立的

CRediT作者贡献声明

Sara Hre??ak：写作–初稿，方法学，调查，概念化。Rok Miklav?i?：写作–初稿，方法学，调查，概念化。Jana Vidi?：写作–审阅与编辑，概念化。David ?kufca：写作–初稿，监督，概念化。Urh ?ernigoj：写作–审阅与编辑，写作–初稿，监督，概念化。Ale? ?trancar：写作–审阅与编辑，监督，资金获取

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本论文报告的工作。

致谢

感谢Sartorius BIA Separations d.o.o.的Bo?o ?gavc、Vesna Novak、Tadej Sever、Bla? Srebot和Polona Skrt提供旋转柱制备、实验室支持和讨论。感谢Rok Sekirnik对稿件的修订。感谢Slovenia Ajdov??ina的COBIK d.o.o.为我们提供含质粒DNA的大肠杆菌菌体，用于本研究。本手稿提供的内容仅反映作者的观点。

Sara Hre??ak|Rok Miklav?i?|David ?kufca|Jana Vidi?|Ale? ?trancar|Urh ?ernigoj