基于Oxford Nanopore MinION捕获测序作为蜱传疾病独立分子检测的评估

《Ticks and Tick-borne Diseases》：Evaluation of capture sequencing on the Oxford Nanopore MinION as a stand-alone molecular test for tick-borne diseases

蜱传疾病（TBD）的分子诊断需要具备靶向蜱中广泛循环微生物病原体的能力，并需要检测低负荷病原体如Borrelia burgdorferi所需的高灵敏度。下一代测序（NGS）对TBD具有广泛适用性。然而，灵敏度不足和大型基础设施需求限制了该方法在诊断中的效用。将基于捕获的NGS应用于Oxford Nanopore仪器提供了一种替代方法，可提供高灵敏度并具有更小的实验室空间占用。研究人员在Oxford Nanopore MinION上测试了靶向蜱传病原体的捕获探针组合TBDCapSeq的效用。与定量PCR（qPCR）直接比较，研究人员检查了64份全血样本，包括41份来自诊断为莱姆病的患者、7份来自无血清转化的疑似莱姆病患者、12份来自疑似蜱传疾病的有症状个体和4份健康对照。TBDCapSeq比qPCR更敏感。qPCR检测到的所有病原体均被TBDCapSeq正确识别。然而，在41份莱姆病患者样本分析中，TBDCapSeq检出7份B. burgdorferi DNA阳性，而qPCR为3份。此外，通过TBDCapSeq，研究人员还回收了对于下游系统发育分析至关重要的大部分基因组。该研究表明捕获测序在TBD分子诊断中的潜在效用。

研究背景：蜱传疾病（tick-borne diseases，TBD）在美国发病率上升，部分与蜱种群地理范围扩大、公众意识提高和诊断策略进步有关。莱姆病（Lyme disease）主要由Borrelia burgdorferi引起，估计每年>400,000例，是最常见TBD和诊断检测主要焦点。由于螺旋体血症（spirochetemia）低且短暂，分子检测对B. burgdorferi检测效用有限；当前莱姆病诊断主要依赖血清学（serology），早期感染灵敏度低且不能识别与其他蜱传病原体共感染。B. burgdorferi主要媒介Ixodes scapularis可传播Borrelia miyamotoi、Borrelia mayonii、Babesia microti、Anaplasma phagocytophilum、Ehrlichia muris eauclairensis和Powassan virus；蜱中多微生物感染不罕见，单次蜱咬可传播多种病原体。TBD共感染诊断困难因病原检测方法不同：莱姆病用血清学，急性无形体病和巴贝虫病推荐聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）。多重PCR可靶向>1种病原体，但靶向设计限制全面识别TBD病原体。下一代测序（next generation sequencing，NGS）有吸引力但昂贵；宏基因组NGS（metagenomic NGS，mNGS）可检测广泛微生物，优于靶向定量PCR（quantitative PCR，qPCR），且基因组数据可指导系统发育和毒力研究；但低灵敏度、高成本和大量基础设施限制其用于研究和实验室开发检测级诊断。捕获测序（capture sequencing）用生物素化DNA探针沿病原体基因组全长设计，选择性结合目标模板，较标准NGS有3至4个数量级改善并可超过PCR。研究人员开发TBDCapSeq（Tick-Borne Disease Capture Sequencing assay），探针靶向北美主要循环蜱传病原体，并在全血、动物组织和蜱样本中显示优于其他分子检测；最初在Illumina测序仪开发，近期适配Oxford Nanopore Technologies（ONT）MinION。MinION尺寸小，是吸引且经济的诊断替代。本研究评估TBDCapSeq在MinION上的诊断潜力，讨论其效用、适应性和应用。研究人员开展描述性评估，未进行正式样本量或功效计算；用64份全血样本比较TBDCapSeq与qPCR，发现TBDCapSeq更敏感，所有qPCR阳性均被正确识别；41例确诊莱姆病中TBDCapSeq检出7例B. burgdorferi DNA阳性，qPCR为3例；还回收下游系统发育分析所需大部分基因组。意义：展示捕获测序用于TBD分子诊断的潜在效用，并显示广谱检测、共感染识别、系统发育和公共卫生监测价值；但低螺旋体血症仍限制B. burgdorferi检测。

关键技术方法：研究纳入64份全血样本，来自两个队列：Lyme Disease Biobank（LDB）队列50份（41份实验室确诊莱姆病、7份疑似莱姆病无血清转化、2份健康对照）和Stony Brook University Medical Center（SB）队列14份（12份疑似TBD有症状个体、2份健康对照；SB无既往诊断数据）。样本盲法检测。采用靶向蜱传病原体的TBDCapSeq捕获探针组合，在Oxford Nanopore MinION上测序，并与qPCR直接比较；对B. burgdorferi阳性样本用Illumina TBDCapSeq重测序验证。生物信息分析包括去多重、过滤、去除人源reads、比对病原体基因组数据库、BLAST及定制脚本判定阳性。

研究结果：
3.1 样本输入优化：比较100 ng与500 ng DNA输入及1500 ng与3000 ng捕获池，4份qPCR阳性血样中3份随输入增加B. burgdorferi reads和覆盖提高，故临床样本采用每份500 ng建库、每库1000 ng（3库共3000 ng）捕获。结论：提高输入可增强检出而未显示建库负面影响。
3.2 全血样本分析—SB队列：12份疑似TBD中TBDCapSeq-ONT检出5份病原体，包括4份A. phagocytophilum（覆盖25%、64%、88%、96%）和1份Ehrlichia chaffeensis（5%覆盖）；并识别1例A. phagocytophilum与B. burgdorferi共感染；qPCR与测序100%一致，2份健康对照阴性。
3.3 全血样本分析—LDB队列：确诊莱姆病41份中既往qPCR阳性3份（7%），TBDCapSeq检出7份（17%）B. burgdorferi reads（7–72条）；2份最高reads多数映射染色体（回收1.6%和1%），其他5份仅映射cp32质粒（cp32 plasmid）。Illumina重测序验证与MinION相似：7份均有B. burgdorferi reads，3份qPCR阳性主要映射染色体，4份qPCR阴性以cp32为主。另检出5份（12%）B. microti（覆盖1%–97%），其中4份qPCR阳性、LYM-2115（207 reads、1%基因组）qPCR阴性；这些样本未检出B. burgdorferi reads。疑似莱姆病样本中1份Ehrlichia chaffeensis阳性。结论：TBDCapSeq较qPCR更敏感，但B. burgdorferi reads低且部分仅cp32；可检出其他病原和共感染。
3.4 单样本捕获与分析：选LDB 4份样本（1份阳性LYM-2047，3份阴性LYM-1987、LYM-2003、LYM-2108），用3000 ng单样本捕获与1000 ng池化比较；阳性样本总reads由3百万增至10百万，但B. burgdorferi reads仅由27增至39，覆盖增加边际，且两次均仅回收cp32-borne reads；3份阴性仍阴性。结论：池化策略未显著降低灵敏度，阴性更可能反映病原DNA稀少/缺失。

讨论总结：低灵敏度和广谱病原检测是TBD早期检测主要挑战。莱姆病中短暂螺旋体血症和低病原负荷需超灵敏方法；PCR因采样时螺旋体量少或缺失而对B. burgdorferi血液核酸检测无效，美国缺乏美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准的莱姆病分子检测。理想方法应兼具广谱检测和区分北美约20种循环蜱传细菌、病毒和寄生虫病原体。捕获NGS可提供关键改进但有注意事项。qPCR适合高负荷病原如A. phagocytophilum或B. microti；对这类病原，捕获测序仍有优势：TBDCapSeq的基因组回收可用于系统发育分析或识别新种；捕获探针耐受更大序列差异（常在50–60%序列一致性下有效），而靶向PCR需近乎完美引物结合；qPCR限于少数预定义病原体，捕获富集保留广谱检测能力，对流行病学和公共卫生监测必要；可识别共感染。莱姆病队列记录>10%与B. microti共感染，与既往分析一致。即使有捕获，<20%实验室确诊莱姆病样本检出B. burgdorferi DNA；增加样本输入可提高阳性样本基因组回收，但DNA阴性样本三倍文库浓度仍无B. burgdorferi reads，提示部分样本中B. burgdorferi缺失或低于可检测量，短暂螺旋体血症仍是分子检测主要限制。5份PCR阴性样本仅检出cp32质粒reads，可能因低测序深度下基因组随机性和靶标冗余；cp32质粒为高度同源环状前噬菌体，在B. burgdorferi中可达9拷贝，在几乎无B. burgdorferi DNA（每检测<1个基因组）时仅cp32序列可能被回收；高螺旋体血症样本中染色体reads多于cp32。NGS尚未广泛用于临床微生物学：流程更复杂、需专门实验室基础设施和专业知识、运营成本高、周转时间长；索引跳跃（index-hopping）和样本交叉污染是额外问题；富集文库可能含高浓度病原序列，多重测序中少量index错配可产生假阳性，尤其急性巴贝虫病高寄生虫血症导致reads过多。改进包括自动化、使用唯一双端索引（unique dual indices）和严格生物信息过滤降低index-hopping/交叉污染；捕获富集提高灵敏度允许较低测序深度和更高度多重/样本批处理，降低每样本运行成本。FDA尚未批准NGS用于临床微生物学，但技术有巨大前景。研究结论翻译：该研究表明捕获测序在蜱传疾病分子诊断中的潜在效用。